Изоляция, дифференцировку и Количественная человеческого антитела секретирующие В-клетки из крови: Elispot в качестве функционального считывания показаний гуморального иммунитета

В-клетки играют центральную роль в развитии гуморального иммунитета. Они изначально развиваются в костном мозге и попадает в кровь в виде наивных В-клеток, которые могут мигрировать в лимфоидные ткани, такие как селезенка, лимфатические узлы, а также миндалин, для дальнейшего развития. При столкновении Ag, некоторые наивные В-клетки мигрируют в лимфоидные фолликулы, где зародышевых центр В-клетки могут дифференцироваться в В-клетки памяти и plasmablasts (УБ) / плазмоцитов (ПК). В то время как большинство ФБФР / ПК EGRESS в поток крови, несколько в конечном счете находятся в костном мозге , чтобы пройти терминальной дифференцировки в долгоживущих ПК ^1. В – клетки , находящиеся в обращении являются гетерогенными, и в стационарном состоянии, ФБФР / ПК редки в периферической крови ^2. В результате наличия поверхностных маркеров линии дифференцировки специфических, проточной цитометрии стало популярным методом для идентификации и характеристики подмножеств В-клеток в периферической крови. Расширенное применение cytometr потокаY является добавление функции сортировки клеток, что позволяет разделение и выделение отдельных подмножеств В-клеток с высокой степенью чистоты. На основе экспрессии специфических рецепторов на поверхности на разных стадиях развития, человека , циркулирующие В – клетки , как правило , подразделяются на три основных субпопуляций: наивных В – клеток (CD19 ⁺ CD27 ^– CD38 ^-), В – клетки памяти (CD19 ⁺ CD27 ⁺ CD38 ^-), и ФБФР / ПК (CD19 ⁺ CD27 ⁺ CD38 ^{+) 3-4} (Рисунок 1). Наивные В-клетки по своей природе не сталкивались с АГС. Тем не менее, они могут быть дифференцированы в клетки IgM ⁺ CD27 ⁺ память B. Несмотря на то, наивные В – клетки являются однородными в выражении антиген В-клеточный рецептор (BCR) -associated молекулы (например, CD19, CD20 и CD22) , они неоднородны в своем репертуаре ⁵ иммуноглобулина. Большинство клеток CD27 ⁺ память B могут быть дифференцированы в CD27+ / CD38 ⁺ привет ФБФР / ПК ^6. Кроме того, В – клетки памяти и ФБФР / ПК поликлональные и демонстрируют с развитием и функциональной гетерогенности ^4-7. ФБФР / ПК в обращении, как правило, недолговечны и не выражают CD138, но сделанные осесть в костном мозге будет терминально дифференцируются и долговечны. Терминально дифференцированных ПК выражают CD138 и понижающей регуляции молекулы CD27 на их поверхности ^8. Так как УБ и ПК способны секретировать Abs, во многих случаях они все вместе обозначаются как ИСС. В противоположность этому , ни наивным , В – клетки , ни В – клетки памяти может произвести значительные количества Abs ^9-10. Тем не менее, при выделении, как наивные и В – клетки памяти могут быть дифференцированы в ИСС в течение 3 – 10 дней при помещении в соответствующих условиях культивирования ^{6, 11-15.} На самом деле, ИСС происходит от в пробирке дифференциации доля подобных поверхностных проявлений CD27 и CD38 с теми , непосредственно выделенных фром периферической крови ^6. Кроме того, ИСС дифференцировались в пробирке экспрессируют низкий уровень поверхности CD20, подобный что циркулирующих ФБФР / ПК ^6. Хотя культура происхождения ИСС все недолговечны, они могут секретируют Abs, указывая, что они функционально компетентной и способной внести свой вклад в гуморального иммунитета.

Оба ELISA и ELISpot являются на сегодняшний день наиболее часто применяются методы, с помощью которых получить функциональную информацию о гуморального иммунного ответа. ИФА 96-луночный планшет на основе анализа а, и он часто используется для измерения титры сывороточного АГ-специфических антител и других аналитов (например, цитокины). Это удобно и масштабируемым. ИФА предназначен для использования анализа твердофазного фермента , чтобы обнаружить присутствие антител или других веществ, таких как сыворотка, в жидком образце ^16. Показаниями из сыворотки ELISAs широко используется для представления иммунный ответ организма. Инструмент, необходимый для приобретения повторногоadouts из ИФА является спектрофотометрический микропланшет-ридера. Читателю может определить оптическую плотность (ОП) конечных продуктов , как правило , в результате реакции с пероксидазой хрена (HRP) Абс обнаружения и их специфических субстратов ^17. Что касается отчетности гуморальный иммунный ответ, сывороточные уровни Ab, определенные методом ELISA обозначают коллективный, а не индивидуальный, производительность ИСС в организме. Кроме того, ИФА не принимает во внимание участие В-клетками памяти, которые не секретируют Abs.

Как ELISA, ELISpot является широко используемым методом для обнаружения и мониторинга иммунного ответа в образцах периферической крови ^17-18. ELISpot представляет собой метод, связанные с бутербродом ELISA. В нем, клетки помещают в поливинилиденфторида (ПВДФ) Мембранный спинками лунки 96-луночных микропланшетов для кратковременной культуры. Анализ ELISpot аналогично выполнения вестерн-блоттинга на микропланшет и developinг пятна на PVDF мембрану в каждую лунку. Автоматизированная система для чтения ELISpot или стереомикроскоп для ручного подсчета требуется. Основное преимущество ELISpot в обнаружении иммунного ответа является его превосходная чувствительность в квантификации ИСС и цитокин-секретирующие клетки. Он сообщает их функциональную активность в гуморального и клеточного иммунитета, соответственно. При измерении гуморальной иммунной функции, уровни сывороточного Ab , определенные методом ELISA , и количество ИСС , перечисляемые ELISpot часто коррелируют, но показания данные из этих двух анализов имеют некоторые различия в функциональных последствий ^19-20. Основным преимуществом ELISpot является его чувствительность метода. Уровень сывороточного титра Ab как сообщает ELISA представлены полуколичественно, как OD считываний, обозначающее относительный уровень Ab, или более количественно, так как концентрация считываний, когда известное количество правильных изотипов Abs включена для справки. В отличие от этого, результаты ELISpot являются Presented в качестве абсолютного числа ИСС в пуле клеток , представляющих интерес (например, нефракционированные одноядерные клетки периферической крови (РВМС) и очищенные В – клетки из МНПК). ELISpot может обнаружить одну ASC, но ELISA требует количества Ab от ИСС достичь оптимизированной опробования зависящих от концентрации перед измерением. Следовательно, ELISpot явно превосходит ELISA в чувствительности количественного определения. Кроме того, ELISpot также подходит для количественного определения in vitro на дифференцированные ИСС из активированных В – клеток памяти. Память В-клетки не секретируют Abs, но могут дифференцироваться в ИСС при активации; поэтому они не имеют никакого вклада в сыворотке крови антител, обнаруженных ELISA. Таким образом, ELISpot является методом выбора при измерении иммунного ответа циркулирующих В-клеток памяти после активации в культуре. Это позволяет осуществлять мониторинг содержания долгосрочного гуморального иммунитета.