Summary

Die Isolation, Differenzierung und Quantifizierung von Human-Antikörper-sezernierenden B-Zellen aus Blut: ELISpot als Functional Readout der humoralen Immunität

Published: December 14, 2016
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Summary

Human peripheral blood is commonly used for the assessment of the humoral immune response. Here, the methods for isolating human B cells from peripheral blood, differentiating human B cells into antibody (Ab)-secreting B cells (ASCs) in culture, and enumerating the total IgM- and IgG-ASCs via an ELISpot assay are described.

Abstract

Das Kennzeichen der humoralen Immunität ist funktional ASCs zu erzeugen, das zu synthetisieren und ABS spezifisch für ein Antigen (Ag), beispielsweise einem Pathogen sekretieren, und sind für Wirtsabwehr eingesetzt. Zur quantitativen Bestimmung des funktionellen Status der humoralen Immunantwort eines Individuums, sowohl Serum Abs und Zirkulieren ASCs als funktionelle Auslesungen üblicherweise gemessen. Beim Menschen ist peripherem Blut die bequemste und leicht zugänglich Probe, die zur Bestimmung der humoralen Immunantwort durch den Host B-Zellen hervorgerufen werden können. Distinct B-Zell-Untergruppen, einschließlich ASCS, kann über die Auswahl mit linienspezifischen Ab-konjugierte Mikrobeads oder über Zellsortierung mit Durchflusszytometrie direkt aus dem peripheren Blut isoliert werden. Darüber hinaus kann gereinigtes naiven und Gedächtnis-B-Zellen in Kultur in ASCs aktiviert und differenziert werden. Die funktionellen Aktivitäten von ASCs zu Ab Sekretion beitragen kann durch ELISpot quantifiziert werden, was ein Assay, Enzym konvergiert ist-linked immunoabsorbance-Assay (ELISA) und Western-Blot-Technologien, um die Aufzählung einzelner ASCS auf Einzelzellebene zu ermöglichen. In der Praxis hat sich die ELISPOT-Tests zunehmend verwendet Impfstoffwirksamkeit zu bewerten, wegen der Leichtigkeit der Handhabung einer großen Anzahl von Blutproben. Die Verfahren zur Isolierung von humanen B – Zellen aus dem peripheren Blut, die Differenzierung von B – Zellen in ASCs in vitro und die Verwendung von ELISpot für die Quantifizierung von Gesamt – IgM- und IgG-ASCs wird hier beschrieben.

Introduction

B-Zellen spielen eine zentrale Rolle bei der Entwicklung der humoralen Immunität. Sie entwickeln sich zunächst im Knochenmark und geben Sie den Blutstrom als naive B-Zellen, die in die lymphatischen Geweben, wie der Milz wandern können, Lymphknoten und Mandeln, für die weitere Entwicklung. Bei Ag Begegnung einige naive B-Zellen wandern in Lymphfollikeln, wo Keimzentrum-B-Zellen in den Speicher B-Zellen und Plasmablasten unterscheiden können (PBS) / Plasmazellen (PCs). Während die meisten PBs / PCs in den Blutstrom Egress, liegen einige schließlich im Knochenmark terminale Differenzierung in langlebigen PCs 1 zu unterziehen. B – Zellen im Umlauf sind heterogen, und in einem stabilen Zustand, PBs / PCs sind selten im peripheren Blut 2. Als Folge der Verfügbarkeit von Lineage-spezifische Oberflächenmarker hat Durchflusszytometrie eine beliebte Methode zur Identifizierung und Charakterisierung der B-Zell-Untergruppen in peripherem Blut werden. Eine erweiterte Anwendung von Fluss cytometry ist die Zugabe eines Zellsortierer-Funktion, die die Trennung und Isolation der einzelnen Untergruppen von B-Zellen mit hoher Reinheit ermöglicht. Basierend auf der Expression spezifischer Oberflächenrezeptoren in verschiedenen Entwicklungsstadien werden menschliche zirkulierende B – Zellen allgemein in drei Haupt Subpopulationen: naive B – Zellen (CD19 + CD27 CD38 -), Gedächtnis – B – Zellen (CD19 + CD27 + CD38 -) und PBs / PCs (CD19 + CD27 + CD38 +) 3-4 (Abbildung 1). Naive B-Zellen von Natur haben Ags nicht auf. Jedoch können sie differenziert IgM + CD27 + Gedächtnis – B – Zellen sein. Obwohl naive B – Zellen sind homogene B-Zell – Antigenrezeptor (BCR) -assoziierten Moleküle (zB CD19, CD20 und CD22) sie heterogen in ihrer Immunoglobulin Repertoire in 5 ausdrückt. Die Mehrheit der CD27 + Gedächtnis – B – Zellen können in CD27 unterschieden werden+ / hallo CD38 + PBs / PCs 6. Darüber hinaus Gedächtnis – B – Zellen und PBs / PCs sind polyklonalen und zeigen Entwicklungs und funktionelle Heterogenität 4-7. PBs / PCs im Umlauf sind in der Regel von kurzer Dauer und nicht CD138 Ausdruck bringen, sondern solche aus im Knochenmark zu beruhigen wird terminal differenzieren und werden langlebig. Ausdifferenzierten PCs exprimieren CD138 und CD27 – Moleküle auf ihren Oberflächen 8 herunterregulieren. Da sowohl PBs und PCs geeignet sind, sezer Abs, in vielen Fällen sind sie gemeinsam als ASCS bezeichnet. Im Gegensatz dazu weder naive B – Zellen noch Gedächtnis – B – Zellen können erhebliche Mengen an Abs 9-10 produzieren. Dennoch, als isoliert, sowohl naiven und Gedächtnis – B – Zellen können in 3 in ASCS differenziert – 10 Tage , an denen 6 in der richtigen Kulturbedingungen gelegt, 15.11. In der Tat, abgeleitet ASCS von in vitro Differenzierung teilen ähnliche Oberfläche Ausdrücke von CD27 und CD38 mit denen direkt isoliert from peripheren Blut 6. Darüber hinaus unterscheiden sich die ASCs in vitro eine geringe Oberflächen CD20, ähnlich dem von zirkulierendem PBs / PCs 6 auszudrücken. Obwohl die Kultur stamm ASCs alle kurzlebigen sind, können sie Abs sezernieren, was anzeigt, dass sie funktionell kompetent sind und in der Lage der humoralen Immunität beitragen.

Beide ELISA und ELISpot sind bei weitem die am häufigsten angewandten Methoden, mit denen auf die humorale Immunantwort funktionelle Informationen zu erhalten. ELISA ist ein 96-Well – Platte-basierten Assays, und es ist häufig der Titer des Serums Ag-spezifischen Abs und anderen Analyten (zB Cytokine) zu messen. Es ist bequem und skalierbar. ELISA ist ein Festphasen Enzym – Assay zu verwenden , 16 das Vorhandensein von Abs oder anderen Substanzen, wie Serum, in einer flüssigen Probe nachzuweisen. Die Auslesungen aus Serum ELISAs wurden, um die Immunantwort des Körpers darzustellen weit verbreitet. Ein Werkzeug erforderlich für den Erwerb von Readouts von ELISA-Assays ist ein spektrophotometrische Mikrotiterplatten-Lesegerät. Der Leser kann die optische Dichte (OD) der Endprodukte typischerweise bestimmen , aus der Reaktion von Meerrettich – Peroxidase (HRP) -konjugierte Detektions Abs und ihre spezifischen Substrate resultierenden 17. Hinsichtlich der humoralen Immunantwort auf die Berichterstattung, Serum Ab Ebenen durch ELISA bestimmt bezeichnen die kollektive, nicht aber einzelne, Leistung von ASCS im Körper. Außerdem versagt ELISA berücksichtigt die Beteiligung von Gedächtnis-B-Zellen, die sekretieren Abs nicht.

Wie ELISA ist ELISpot ein weit verbreitetes Verfahren zum Nachweis und der Überwachung der Immunantwort in peripheren Blutproben 17-18. ELISpot ist eine Technik, um einen Sandwich-ELISA bezogen. Darin werden die Zellen in das Polyvinylidendifluorid (PVDF) -Membran-backed Wells von 96-Well-Mikrotiterplatten gegeben für eine Kurzzeitkultur. Der ELISPOT-Assay ist analog zur Durchführung Western-Blotting auf einer Mikrotiterplatte und developing die Flecken auf der PVDF-Membran in jeder Vertiefung. Ein automatisiertes ELISpot Lesesystem oder ein Stereomikroskop für die manuelle Zählung ist nicht erforderlich. Der Hauptvorteil der ELISpot in einer Immunantwort Erfassungs ist seine hervorragende Empfindlichkeit in der Quantifizierung von ASCs und Cytokin-sezernierenden Zellen. Er berichtet ihre funktionellen Aktivitäten in humoralen und zellulären Immunität sind. Bei der Messung der humoralen Immunfunktion, Serum Ab durch ELISA und der Anzahl von ASCs bestimmt Ebenen durch ELISpot aufgezählt werden oft korreliert, aber die Daten Ablesungen aus diesen beiden Assays haben einige Unterschiede in der funktionellen Auswirkungen 19-20. Der Hauptvorteil der ELISpot ist die Empfindlichkeit der Methode. Die Höhe des Serum-Ab-Titer, wie durch ELISA berichtet wird, semi-quantitativ als OD Ablesungen dargestellt, um die relative Ab Ebene bezeichnet, oder mehr quantitativ, als Konzentration Ablesungen, wenn eine bekannte Menge an den richtigen Isoformen der ABS ist als Referenz enthalten. Im Gegensatz dazu sind die Ergebnisse der ELISpot presented als die absolute Zahl der Anbeterinnen in einem Zellpool von Interesse (zB unfraktioniertem einkernigen peripheren Blutzellen (PBMCs) und gereinigte B – Zellen aus PBMCs). ELISpot können einen einzelnen ASC erkennen, aber ELISA erfordert Ab Mengen von ASCS optimierten Assay abhängigen Konzentrationen vor der Messung zu erreichen. Daher ELISpot ist offensichtlich überlegen ELISA in Empfindlichkeit der Quantifizierung. Außerdem ist ELISpot auch für die in vitro differenzierte ASCs von aktivierten Gedächtnis – B – Zellen zu quantifizieren. Gedächtnis-B-Zellen sezernieren Abs nicht aber in ASCS bei Aktivierung unterscheiden kann; Sie haben daher keinen Beitrag zum Serum durch ELISA nachgewiesen Abs. Somit ist ELISpot die Methode der Wahl bei der Messung der Immunantwort des Speichers B-Zellen nach der Aktivierung in Kultur zirkuliert. Es ermöglicht die Überwachung der Aufrechterhaltung der Langzeit humorale Immunität.

Protocol

Menschliche periphere Blut muss von gesunden Spendern unter informierte Einwilligung eingeholt werden, und die Verwendung von Blutproben müssen den genehmigten Leitlinien, die einzelnen Institutional Review Boards entsprechen. In dieser Studie auf das Protokoll menschlichem Blut an einer Demonstration der Ergebnisse der Durchflusszytometrie (Abbildung 1) und ELISPOT – Tests verwenden (Abbildung 3) wurde durch den Internal Review Board der National Taiwan University Hospital (Protokollnummer 201307019RINB) …

Representative Results

PBMCs wurden von roten Blutkörperchen und anhaftenden Zellen verarmt (Schritte 1,2 bis 1,7). Ein Aliquot (2 x 10 6) Zellen wurden zu einer durchflusszytometrischen Analyse unterzogen , um die Populationen von naiven B – Zellen, Gedächtnis – B – Zellen und PBS / PCs in dem peripheren Blut (Abbildung 1) veranschaulichen. In diesem PBMCs des Spenders, etwa 10% der Lymphozyten waren CD19 + B – Zellen. In der B-Zellenraum ist der Anteil der CD19 +…

Discussion

Isolierung und Reinigung von humanen peripheren Blut-B-Zellen

Normalerweise können RBCs effizient durch Lysepuffer (Schritt 1.2) gebrochen und gelöscht werden. Es ist wichtig, nicht die PBMCs mit dem RBC-Lyse-Puffer länger als 5 min inkubieren, da die Lebensfähigkeit der Zellen kann durch das Ammoniumchlorid beeinflußt werden. Alternativ kann RBCs und Blutplättchen gleichzeitig durch das folgende Protokoll entfernt werden.

Mischen frisches Vollblut mit Säure-…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This study was supported by a research grant from the Ministry of Science and Technology of the Executive Yuan of Taiwan (NSC99-2320-B-002-011). I would like to acknowledge the excellent service provided by the Flow Cytometric Analyzing and Sorting Core of the First Core Laboratory in College of Medicine of National Taiwan University.

Materials

BD Vacutainer K2E BD Biosciences 367525 10 ml tube
Ficoll-Paque Plus GE Healthcare 17-1440-02 endotoxin-free
Trypan blue 0.5% solution Biological Industries 03-102-1B
IMag Human B lymphocyte enrichment set BD Biosciences 558007
Biotinylated CD27 mAb Biolegend 302804 clone O323
Streptavidin magnetic microbeads BD Biosciences 9000810
15 ml Falcon tubes BD Falcon 352196
Blue nylon mesh cell strainer, 40 μm BD Falcon 352340
Anti-human CD19-APC Biolegend 302212 clone HIB19
Anti-human CD27-eFluor 450 eBioscience 48-0279-42 clone O323
Anti-human CD38-PE-Cy7 Biolegend 303516 clone HIT2 
Anti-human CD38-PE-Cy7 BD Biosciences 560677 clone HIT2 
Anti-human CD45-FITC Biolegend 304006 clone HI30
Anti-human CD45-FITC BD Biosciences 555482 clone HI30
Anti-mouse/rat/human CD27-PerCP Cy5.5 Biolegend 124213 clone LG.3A10
Anti-human CD27-PerCP Cy5.5 BD Biosciences 65429 clone L128
Anti-human CD19-FITC Miltenyi Biotec 130-098-064 clone LT19
Anti-human CD19-FITC GeneTex GTX75599 clone LT19
Anti-human CD20-FITC BD Biosciences 555622 clone 2H7
biotinylated anti-human CD27 Biolegend 302804 clone O323
biotinylated anti-human CD27 eBioscience 13-0279-80 clone O323
7-aminoactinomycin D (7-AAD) BD Biosciences 559925
CpG (ODN 2006)  InvivoGen tlrl-2006 type B CpG
Recombinant human IL-2 PeproTech 200-02
Recombinant human IL-10 PeproTech 200-10
Recombinant human IL-21 PeproTech 200-21
Recombinant human sCD40L PeproTech 310-02
Protein A of S. aureus Cowan (SAC) Sigma-Aldrich 82526
Pokeweed mitogen (PWM) Sigma-Aldrich L9379
MultiScreen filter plates, 0.45 µm pore size Merck Millipore MSIPS4510 sterile, clear 96-well filter plate with hydrophobic PVDF membrane
BCIP/NBT solution Sigma-Aldrich B6404
BCIP/NBT single reagent, alkaline phosphatase substrate Merck Millipore ES006
Human IgG Jackson ImmunoResearch 009-000-003
Human IgG, Fc fragment Jackson ImmunoResearch 009-000-008
F(ab')2 fragment of goat anti-human Ig (IgG+IgM+IgA) Jackson ImmunoResearch 109-006-127
Goat anti-human IgG-alkaline phosphatase, Fcγ fragment specific Jackson ImmunoResearch 109-055-008
Goat anti-human IgM-alkaline phosphatase, Fcµ fragment specific Jackson ImmunoResearch 109-055-095
Goat anti-human IgG-peroxidase, Fcγ fragment specific Jackson ImmunoResearch 109-035-008
Goat anti-human IgM-peroxidase, Fcµ fragment specific Jackson ImmunoResearch 109-035-095
BD ELISPOT AEC substrate kit BD Biosciences 551951
C.T.L. ImmunoSpot analyzer C.T.L.

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Tzeng, S. The Isolation, Differentiation, and Quantification of Human Antibody-secreting B Cells from Blood: ELISpot as a Functional Readout of Humoral Immunity. J. Vis. Exp. (118), e54582, doi:10.3791/54582 (2016).

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