L'isolamento, la differenziazione e quantificazione di Human anticorpo-secernenti cellule B da sanguigno: ELISpot come una lettura funzionale del umorale immunità

cellule B svolgono un ruolo centrale nello sviluppo di immunità umorale. Inizialmente si sviluppano nel midollo osseo ed entrano nel flusso sanguigno come cellule naive B, che possono migrare nei tessuti linfoidi, come la milza, i linfonodi, tonsille e, per un ulteriore sviluppo. Su Ag incontro, alcune cellule B naïve migrano in follicoli linfoidi, dove il centro germinale cellule B possono differenziarsi in cellule di memoria B e plasmablasts (PBS) / plasmacellule (PC). Mentre la maggior parte dei PC PBS / uscita nel flusso sanguigno, alcuni infine risiedono nel midollo osseo di sottoporsi a differenziazione terminale nei PC di lunga durata ^1. Cellule B in circolazione sono eterogenei, e allo stato stazionario, PBS / PC sono rari nel sangue periferico ^2. Come risultato della disponibilità di marcatori di superficie specifici lineage, citometria a flusso è diventato un metodo popolare per l'identificazione e la caratterizzazione dei sottoinsiemi B-cellule nel sangue periferico. Un'applicazione estesa di cytometr flussoy è l'aggiunta di una funzione cell sorter, che permette la separazione e l'isolamento di singoli sottogruppi di cellule B con elevata purezza. Sulla base della espressione dei recettori di superficie specifici a diversi stadi di sviluppo, che circolano cellule B umane sono generalmente classificati in tre sottopopolazioni principali: le cellule B naive (CD19 ⁺ CD27 ^– CD38 ^-), le cellule B di memoria (CD19 ⁺ CD27 ⁺ CD38 ^-), e PBS / PC (CD19 ⁺ CD27 ⁺ CD38 ^{+) 3-4} (Figura 1). le cellule B naïve per natura non hanno incontrato Ags. Tuttavia, possono essere differenziate in cellule IgM ⁺ CD27 ⁺ B di memoria. Anche se le cellule B naïve sono omogenei nell'esprimere recettore per l'antigene delle cellule B (BCR) molecole -associated (ad esempio, CD19, CD20 e CD22) siano eterogenei nella loro immunoglobuline repertorio ^5. La maggior parte delle cellule CD27 ⁺ B di memoria può essere differenziato in CD27+ / hi CD38 ⁺ PBS / PC ^6. Inoltre, le cellule B di memoria e PBS / PC sono policlonali ed esibiscono evolutiva e funzionale l'eterogeneità ^4-7. PBS / PC in circolazione sono normalmente di breve durata e non esprimono CD138, ma quelli fatti di stabilirsi nel midollo osseo saranno terminali differenziare e diventare di lunga durata. Terminalmente differenziate PC esprimono CD138 e giù-regolano le molecole CD27 sulla loro superficie ^8. Dal momento che sia PB e PC sono in grado di secernere Abs, in molte occasioni sono collettivamente indicati come ASC. Al contrario, né le cellule B naïve né cellule B di memoria in grado di produrre quantità apprezzabili di Abs ^9-10. Tuttavia, quando isolato, entrambe le cellule B naive e memoria possono essere differenziati in ASC in 3 – 10 giorni, quando sono immessi nelle condizioni di coltura appropriate ^{6, 11-15.} Infatti, ASC derivati da in vitro la differenziazione delle azioni simili espressioni superficiali di CD27 e CD38 con i diretti isolato frsangue periferico om ^6. Inoltre, le ASC differenziate in vitro esprimono un basso livello di CD20 superficie, simile quella di PBS / PC ⁶ in circolazione. Anche se le ASC cultura di derivazione sono tutti di breve durata, possono secernono Abs, che indica che essi sono funzionalmente competenti e in grado di contribuire alla immunità umorale.

Sia ELISA e ELISpot sono di gran lunga i metodi più comunemente applicato con cui ottenere informazioni funzionali sulla risposta immunitaria umorale. ELISA è un test piastra base 96 pozzetti, ed è utilizzato frequentemente per misurare i titoli di siero Abs Ag-specifica ed altri analiti (ad esempio, citochine). E 'conveniente e scalabile. ELISA è progettato per utilizzare un saggio enzimatico in fase solida per rilevare la presenza di Abs o altre sostanze, quali siero, in un campione liquido ^16. Le letture da ELISA siero sono stati ampiamente utilizzati per rappresentare la risposta immunitaria del corpo. Uno strumento necessario per l'acquisizione di riadouts da ELISA test è un lettore spettrofotometrico. Il lettore può determinare la densità ottica (OD) dei prodotti finali tipicamente risultanti dalla reazione di perossidasi di rafano (HRP) coniugata Abs rilevamento e loro substrati specifici ^17. Per quanto riguarda la segnalazione della risposta immunitaria umorale, livelli sierici Ab determinati mediante ELISA denotano collettivo, ma non individuale, prestazioni di ASC nel corpo. Inoltre, ELISA non tiene conto della partecipazione dalle cellule B di memoria, che non secernono Abs.

Come ELISA, ELISpot è un metodo ampiamente utilizzato per la rilevazione e il monitoraggio della risposta immunitaria nei campioni di sangue periferico ^17-18. ELISpot è una tecnica relativa a un sandwich ELISA. In esso, le cellule vengono inseriti nella difluoruro di polivinilidene (PVDF) pozzi membrana-backed di 96 pozzetti per una cultura a breve termine. Il saggio ELISPOT è analogo all'esecuzione di western blotting su una micropiastra e developing le macchie sulla membrana PVDF in ogni pozzetto. è richiesto un sistema di lettore ELISpot automatico o uno stereomicroscopio per il conteggio manuale. Il vantaggio principale di ELISpot nel rilevare una risposta immunitaria è la sua eccezionale sensibilità nella quantificazione di ASC e cellule secernenti citochine. Riporta le loro attività funzionali in immunità umorale e cellulare, rispettivamente. Nella misurazione della funzione immunitaria umorale, livelli sierici Ab determinati mediante ELISA e il numero di ASC enumerate da ELISpot sono spesso correlati, ma le letture dati da questi due saggi hanno alcune differenze nelle implicazioni funzionali ^19-20. Il vantaggio principale di ELISpot è la sua sensibilità del metodo. Il livello di siero titoli Ab come riportato da ELISA è presentato semi-quantitativamente come letture OD, che indica il livello Ab relativa, o più quantitativamente, come letture di concentrazione quando una quantità nota dei propri isotipi di Abs è incluso per riferimento. Al contrario, i risultati di ELISpot sono Presented come il numero assoluto di ASC in un pool di cellule di interesse (ad esempio, le cellule mononucleate del sangue periferico non frazionate (PBMC) e le cellule B purificate da PBMC). ELISpot può rilevare una singola ASC, ma ELISA richiede quantità Ab da ASC raggiungere concentrazioni dosaggio-dipendente ottimizzate prima della misura. Quindi, ELISpot è ovviamente superiore a ELISA nella sensibilità di quantificazione. Inoltre, ELISpot è adatto anche per quantificare le ASC differenziate in vitro da cellule B di memoria attivate. le cellule B di memoria non secernono Abs ma possono differenziarsi in ASC al momento di attivazione; non hanno quindi alcun contributo di Abs siero rilevati da ELISA. Così, ELISpot è il metodo di scelta nella misurazione della risposta immunitaria delle cellule B della memoria circolanti dopo l'attivazione in coltura. Esso consente il monitoraggio del mantenimento dell'immunità umorale a lungo termine.