Medida de<em> In Vitro</em> Integración Actividad del VIH-1 preintegration Complejos

VIH-1 de replicación en la célula diana implica varios pasos, en términos generales, agrupadas en dos fases: eventos tempranos y tardíos. Los primeros eventos comienzan cuando el VIH-1 secuencialmente une a la superficie de la célula diana receptor CD4 y uno de los dos co-receptores (CCR5 o CXCR4) ^1. En consecuencia, el fusible membranas virus-célula, y la cápside viral (CA) de núcleo se libera en el citoplasma ^2. El núcleo CA contiene el ARN viral genómico de cadena sencilla (ssRNA) y varias proteínas, tanto virales y celulares de origen. Las proteínas virales CA-asociados incluyen la transcriptasa inversa (RT) y la integrasa (IN), dos enzimas que median pasos críticos durante los primeros eventos en la replicación viral. El RT y EN la función en el contexto de complejos de nucleoproteína, a saber, la transcripción inversa Complex (RTC) y el complejo de pre-integración (PIC), respectivamente ^{3, 4, 5} <sup>, ^6. Los extremos del genoma viral de ARN de cadena simple terminal del puerto de repetición (R) elementos adyacentes a la U5 secuencias únicas (en el extremo 5 ') y U3 (en el extremo 3'). El RTC convierte el genoma ARN de cadena simple viral en un (ds) de copias de ADN de doble cadena (ADNv). Este proceso de transcripción inversa también da lugar a la duplicación de las secuencias U5 y U3, generando así repeticiones terminales largas (LTR) en ambos extremos de la ADNv ^{7, 8.} Posteriormente, el IN PIC-asociado cataliza dos reacciones bioquímicas secuenciales que permiten la integración de la ADNv en el cromosoma huésped ^{9, 10, 11.} En primer lugar, en el citoplasma, IN multímeros participar ambas LTRs ¹² y escindir un dinucleótido de cada uno de los extremos 3'-terminales. Este procesamiento extremo 3 'genera un grupo hidroxilo en cada extremo 3' (CA _OH) de la ADNv.A continuación, PIC trafica al núcleo, en el que en el ADNv utiliza CA _OH como nucleófilo para cortar ambas cadenas del ADN cromosómico de una manera escalonada. Simultáneamente, en empalmes coordinadamente ambos extremos del ADNv a los enlaces fosfodiéster resultantes en cadenas opuestas del ADN cromosómico. Después de esta etapa de transferencia de cadena, la maquinaria de la célula huésped elimina los dos nucleótidos no apareados en los extremos 5 'de la vDNA y reparaciones de las brechas de cadena sencilla consiguientes en la unión del sitio de integración. Así, los primeros eventos culminan con la creación de una copia de ADN integrado (provirus) del genoma del VIH-1. El provirus proporciona un entorno adecuado para la expresión génica viral eficiente, que inicia los eventos posteriores, incluyendo la expresión de las proteínas codificadas por el virus; ensamblaje del virus inmaduro; y en ciernes, la liberación y la maduración en viriones infecciosos ^13.

Retroviral recombinante purificada EN es competente parallevar a cabo, in vitro, tanto en las actividades de procesamiento y el capítulo de transferencia del extremo 3 'de ADN exógena suministrados sustrato LTR-similares. Los estudios bioquímicos utilizando dicha purificado en recombinante han puesto de manifiesto los aspectos críticos de la integración ADNv ^{14, 15, 16, 17.} Sin embargo, a diferencia de la infección natural, esta reacción bioquímica in vitro no es compatible con la integración concertada de ambos extremos del sustrato de ADN en el ADN objetivo. Por el contrario, PICs retrovirales aisladas de células infectadas de forma aguda se integran concertada ambos extremos de la ADNv endógeno en el ADN diana heterólogo. Esto condujo a la adopción generalizada y posteriores refinamientos de ensayos in vitro de Integración (IVI) E n el uso de los PIC nativas aisladas.

En la primera informado ensayo retroviral IVI, extractos citoplasmáticos de células infectadas con un recombinante murinoVirus de la leucemia (MLV) que alberga el gen E. coli supF en su LTR sirvió como la fuente de la actividad de IN, y el ADN de un fago lambda mutante defectuoso en el crecimiento lítico fue suministrado exógenamente como el ADN diana. La integración exitosa del ADN recombinante MLV copia en el ADN del fago y la consiguiente p F expresión condujo a la restauración de la capacidad formadora de placa de los fagos recombinantes. Sin embargo, esta estrategia experimental es laborioso y medidas de integración de una manera indirecta. Para hacer frente a estas advertencias, un ensayo de marcaje terminal indirecto basado en la transferencia de Southern, que cuantifica la actividad IVI PIC-asociado como una medida de la ADNv endógeno integrado en el ADN exógeno phiX174 bacteriófago linealizado, se desarrolló ^{6, 7, 18.} Aunque este método proporciona una medida directa de eventos de integración, se requieren cantidades relativamente altas de preparación PIC, que sigue siendo un desafío técnicoesfuerzo. Para evitar esto, ensayos basados en PCR anidados que requieren sólo cantidades modestas de PICs se desarrollaron ^{4, 5, 19.}

En este informe se describe una versión actualizada de una PCR anidada-basado en el método in vitro ideado para recapitular la actividad de integración mediada PIC VIH-1 se produce durante la infección natural. Este método utiliza los extractos citoplasmáticos de las células diana infectadas por VIH-1 como fuente de actividad endógena PIC, que se mide con un tiempo real de la polimerasa cuantitativa reacción en cadena (qPCR). Los procedimientos para el aislamiento de los PIC y la medición de sus actividades de integración se adaptan, con modificaciones, a partir de los protocolos publicados por el laboratorio Engelman ^20. En este método, la actividad de integración PIC-asociado se inicia proporcionando una diana de ADN exógeno lineal ^21, y los productos de ADN resultantes deesta reacción integración se purifican y se utiliza como material de partida para la cuantificación basada en la PCR subsiguiente. En la primera ronda de PCR convencional, las uniones de ADN viral diana se amplifican mediante el uso de cebadores apropiados. En la segunda ronda qPCR, cebadores LTR-específicos se utilizan para enriquecer específicamente a la población a partir de los vDNA primera ronda productos de PCR. Por favor, vea la sección de protocolo para una descripción detallada de este método.

Los estudios in vitro con PICs retrovirales han dado lugar a avances significativos en nuestra comprensión del mecanismo de integración del ADN retroviral y en el desarrollo de inhibidores de la IN. Sobre la base de la reciente mayor enfoque en la cartografía del VIH-1 sitios de integración, la determinación del papel de los factores virales y del huésped en el VIH-1 la integración y desarrollo de nuevos fármacos antivirales para combatir la resistencia a los medicamentos, prevemos un aumento del interés y el uso generalizado de los ensayos de IVI , como el descrito en este informe. Esto, a su vez, dará lugar afuturas mejoras en el método, diversificando de esta manera el alcance de sus aplicaciones.