Mesure de<em> In vitro</em> Activité d'intégration du VIH-1 préintégration Complexes

HIV-1 replication dans la cellule cible implique plusieurs étapes, de façon générale regroupées en deux phases: les événements précoces et tardifs. Les événements précoces commencent lorsque le VIH-1 de façon séquentielle se lie au récepteur de surface des cellules cibles CD4 et l' un des deux co-récepteurs (CCR5 ou CXCR4) ^1. Par conséquent, la membrane fusible virus des cellules, et la capside virale (CA) de base est libérée dans le cytoplasme ^2. Le noyau CA contient l'ARN viral génomique simple brin (ssRNA) et plusieurs protéines, à la fois virale et cellulaire à l'origine. Les protéines virales associées CA comprennent la transcriptase inverse (RT) et intégrase (IN), deux enzymes qui interviennent dans les étapes critiques pendant les événements précoces de la réplication virale. La RT et IN fonction dans le contexte des complexes de nucléoprotéine, à savoir la transcription inverse complexe (RTC) et le complexe de pré-intégration (PIC), respectivement ^{3, 4, 5} <sup>, ^6. Les extrémités du génome viral de ssRNA terminal portuaire répétition (R) des éléments adjacents aux séquences U5 uniques (à l'extrémité 5 ') et U3 (à l'extrémité 3'). Le RTC convertit le ssRNA génome viral dans un (ds) copie d'ADN double brin (vDNA). Ce processus de transcription inverse se traduit également par une duplication des séquences U3 et U5, générant ainsi des longues répétitions terminales (LTR) aux deux extrémités de la vDNA ^{7, 8.} Par la suite, IN PIC associé catalyse deux réactions biochimiques successives qui permettent l'intégration du vDNA dans le chromosome hôte ^{9, 10, 11.} Tout d' abord, dans le cytoplasme, IN multimères s'engager les deux LTR et ¹² cliver un dinucléotide à partir de chacune des extrémités 3 'terminales. Ce traitement génère l' extrémité 3 ' d' un groupe hydroxyle à chaque extrémité 3' _(OH CA) de la vDNA.Ensuite, PIC trafique vers le noyau, dans lequel IN utilise le vDNA CA _OH comme nucléophile pour couper les deux brins de l'ADN chromosomique en quinconce. Simultanément, se dissocie de façon coordonnée les deux extrémités du vDNA aux liaisons phosphodiester résultant sur des brins opposés de l'ADN chromosomique. Après cette étape de transfert de brin, la machinerie de la cellule hôte supprime les deux nucléotides non appariés aux extrémités 5 'de la vDNA et répare les lacunes simple brin qui en découlent à la jonction du site d'intégration. Les événements précoces aboutissent donc à la création d'une copie d'ADN intégré (provirus) du génome du VIH-1. Provirus fournit un environnement approprié pour l'expression des gènes viraux efficaces, ce qui déclenche des événements ultérieurs, y compris l'expression des protéines codées par le virus; assemblage du virus immature; et le bourgeonnement, la libération et la maturation dans des virions infectieux ^13.

Purifié rétroviral IN recombinant est compétent pourréaliser, in vitro, les deux traitement et de transfert de brin activités 3'-terminales sur exogène ADN substrat LTR-like. Des études biochimiques utilisant de tels recombinant purifié IN ont révélé des aspects critiques de l' intégration vDNA ^{14, 15, 16, 17.} Cependant, contrairement à une infection naturelle, cette réaction biochimique in vitro ne supporte pas l' intégration concertée des deux extrémités de l'ADN de substrat dans l'ADN cible. En revanche, les PIP rétrovirales isolées à partir de cellules infectées de façon aiguë intégration concertée des deux extrémités du vDNA endogène dans un ADN cible hétérologue. Cela a conduit à l'adoption généralisée et des améliorations ultérieures de Vitro Intégration (IVI) essais I n en utilisant PICs indigènes isolés.

Dans le premier essai rapporté IVI rétroviraux, des extraits cytoplasmiques provenant de cellules infectées par un recombinant murineVirus de la Leucémie (MLV) hébergeant le gène de E. coli SupF dans sa LTR a servi comme source d'activité IN et l'ADN d'un mutant de phage lambda défectueux dans la croissance lytique a été fourni de manière exogène comme l'ADN cible. l'intégration réussie de l'ADN recombinant MLV la copie dans l'ADN du phage et l'expression qui suit SupF conduit à la restauration de la capacité des phages recombinants de formation de plaques. Cependant, cette stratégie expérimentale est laborieuse et l'intégration de mesures d'une manière indirecte. Pour faire face à ces mises en garde, un test de fin marquage indirect basé blot-Sud, qui quantifie l'activité IVI PIC associée en tant que mesure de la vDNA endogène intégré dans bactériophage linéarisé exogène phiX174 ADN, a été mis au point ^{6, 7, 18.} Bien que cette méthode fournit une mesure directe des événements d'intégration, des quantités relativement élevées de la préparation des PIC sont nécessaires, ce qui reste un défi techniqueeffort. Pour contourner cela, des tests basés sur la PCR imbriquées ne nécessitant que des quantités modestes de PICs ont été développés ^{4, 5, 19.}

Dans ce rapport, nous décrivons une version mise à jour d'une PCR nichée à base in vitro conçu pour récapituler l'activité d'intégration du VIH-1 PIC médiée survenant au cours de l' infection naturelle. Cette méthode utilise les extraits cytoplasmiques des cellules cibles du VIH-1 infectées en tant que source d'activité PIC endogène, qui est mesurée à l'aide d'une polymérase en temps réel quantitative Chain Reaction (PCR quantitative). Les procédures d'isolement PICs et mesurer leurs activités d'intégration sont adaptées, avec des modifications, des protocoles publiés par le laboratoire Engelman ^20. Dans ce procédé, l'activité d'intégration PIC associée est déclenchée en fournissant un ADN cible exogène linéaire ^21, et les produits d'ADN résultant decette réaction d'intégration sont purifiés et utilisés comme matière de départ pour la quantification par PCR ultérieure. Dans le premier tour de PCR classique, les jonctions d'ADN viral cible sont amplifiés en utilisant des amorces appropriées. Dans le second tour qPCR, amorces LTR-spécifiques sont utilisés pour enrichir spécifiquement la population vDNA des produits de première ronde de PCR. S'il vous plaît voir la section de protocole pour une description détaillée de cette méthode.

Des études in vitro avec PICs rétroviraux ont permis des avancées significatives dans notre compréhension du mécanisme d'intégration de l' ADN rétroviral et dans le développement d'inhibiteurs IN. Sur la base de la récente focalisation accrue sur la cartographie du VIH-1 des sites d'intégration, déterminer le rôle des facteurs viraux et d'accueil du VIH-1 l'intégration et le développement de nouveaux médicaments antiviraux dans la lutte contre la résistance aux médicaments, nous envisageons un intérêt accru et l'utilisation généralisée des IVI essais , comme celle décrite dans le présent rapport. Ceci, à son tour, conduira àaméliorations futures dans la méthode, diversifiant ainsi la portée de ses applications.