قياس ل<em> في المختبر</em> التكامل آخر من HIV-1 Preintegration مجمعات
Summary
This report describes an in vitro assay for measuring the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) preintegration complex (PIC)-associated integration activity in the cytoplasmic extracts of acutely infected cells. The integration of PIC-associated HIV-1 DNA into heterologous target DNA is quantified by using a nested real-time polymerase chain reaction strategy.
Abstract
البروتينات HIV-1 مغلف الانخراط مستقبلات المشابهة على سطح الخلية المستهدفة، الأمر الذي يؤدي إلى الخلية الفيروسية الانصهار غشاء يليها الافراج عن جوهر قفيصة الفيروسية (CA) في السيتوبلازم. وفي وقت لاحق، والناسخ العكسي الفيروسي (RT)، كجزء من تحمل الاسم نفسه البروتين النووي مجمع يسمى النسخ العكسي مجمع (RTC)، يحول الفيروسي RNA الجينوم واحد الذين تقطعت بهم السبل في نسخة الحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل (vDNA). وهذا يؤدي إلى نشوء حيوي من مجمع البروتين النووي أخرى، ووصف المجمع قبل التكامل (PIC)، ويتألف من vDNA والبروتينات فيروس المرتبطة بها والعوامل المضيفة. وإنزيم مدمج الفيروسي المرتبطة الموافقة المسبقة عن علم (IN) ينسق دمج vDNA في الحمض النووي الصبغي المضيفة في عملية من خطوتين ينظم زمنيا ومكانيا. أولا، في عمليات ينتهي 3 'من vDNA في السيتوبلازم، وثانيا، بعد بالاتجار الموافقة المسبقة عن علم إلى النواة، فإنه يتوسط دمج vDNA معالجتها في الحمض النووي الصبغي. بلدان جزر المحيط الهادئ معزولةمن الخلايا المستهدفة المصابة تماما مع HIV-1 وظيفية في المختبر، كما أنها مؤهلة لدمج vDNA يرتبط إلى الحمض النووي الهدف مغاير وأضاف خارجيا. وقد ساهمت في فحوصات المختبر التكامل هذه على أساس الموافقة المسبقة عن علم كبير لترسيم تفاصيل الآلية التكامل للفيروسات، وإلى اكتشاف في مثبطات. في هذا التقرير، إلا أننا الإفاضة محدث HIV-1 فحص الموافقة المسبقة عن علم أن يوظف استراتيجية تستند في عملها متداخلة في الوقت الحقيقي البلمرة الكمية سلسلة من ردود الفعل (QPCR) لقياس النشاط في المختبر التكامل بين بلدان جزر المحيط الهادئ الأم معزولة.
Introduction
HIV-1 تكرارها في الخلية المستهدفة ينطوي على خطوات متعددة، مجمعة على نطاق واسع إلى مرحلتين: الأحداث المبكرة والمتأخرة. تبدأ الأحداث في وقت مبكر عندما يتحد HIV-1 بالتتابع لمستقبلات سطح الخلية المستهدفة CD4 واحد من اثنين شارك في مستقبلات (CCR5 أو CXCR4) 1. وبالتالي، فإن الأغشية فتيل الفيروس الخلية، وقفيصة الفيروسية يتم تحريرها (CA) الأساسية في سيتوبلازم 2. يحتوي لب CA الحمض النووي الريبي الفيروسي الجيني واحد الذين تقطعت بهم السبل (ssRNA) والعديد من البروتينات، سواء الفيروسية والخلوية في الأصل. وتشمل البروتينات الفيروسية المرتبطة CA الناسخ العكسي (RT) وإنزيم مدمج (IN)، اثنين من الانزيمات التي تتوسط خطوات حاسمة خلال الأحداث في وقت مبكر في تكاثر الفيروس. وRT وفي وظيفة في إطار مجمعات البروتين النووي، وهي عكس النسخ مجمع (RTC) ومجمع ما قبل الاندماج (PIC)، على التوالي 3، 4، 5 <سوب>، 6. نهايات الفيروسي ssRNA الجينوم محطة ميناء تكرار (R) عناصر المتاخمة للتسلسل U5 فريد (في 5 'النهاية) و U3 (في 3' نهاية). وRTC يحول الجينوم الفيروسي ssRNA إلى المزدوج تقطعت بهم السبل (س) والحمض النووي نسخة (vDNA). النتائج هذه العملية النسخ العكسي أيضا في ازدواجية U5 وU3 متواليات، وبالتالي توليد يكرر محطة الطويلة (LTR) في كلا طرفي vDNA 7 و 8. وفي وقت لاحق، وفي المصاحب الموافقة المسبقة عن علم يحفز اثنين من التفاعلات الكيميائية الحيوية متسلسلة التي تمكن من دمج vDNA في كروموسوم المضيف 9 و 10 و 11. أولا، في السيتوبلازم، في multimers إشراك كلا لتر 12 و يلتصق على ثنائي النوكليوتيد من كل من طرفي 3'-الطرفية. هذه المعالجة 3'نهاية يولد مجموعة الهيدروكسيل في كل نهاية 3'(CA OH) من vDNA.بعد ذلك، الموافقة المسبقة عن علم بالاتجار إلى النواة، حيث يستخدم في vDNA CA OH كما نيوكليوفيل لخفض كل من خيوط من الحمض النووي الصبغي بطريقة متداخلة. في وقت واحد، في التوصيلات coordinately طرفي vDNA لينتج عن ذلك من السندات phosphodiester على مسارات المقابل من الحمض النووي الصبغي. وبعد هذه الخطوة نقل حبلا، آلية الخلية المضيفة يزيل اثنين من النيوكليوتيدات المفردة في نهايات 5 'من vDNA وإصلاح الثغرات واحدة الذين تقطعت بهم السبل التي تلت ذلك عند تقاطع للموقع التكامل. وبالتالي بداية أحداث ذروتها مع إنشاء نسخة الحمض النووي المتكاملة (طليعة الفيروس) للجينوم HIV-1. تقدم طليعة الفيروس بيئة مناسبة للتعبير الجين الفيروسي كفاءة، الذي يبدأ أحداث لاحقة، بما في ذلك التعبير من البروتينات المشفرة فيروس. التجمع من الفيروس غير ناضجة. ومهدها، وإطلاق سراح، والنضج في virions المعدية (13).
المنقى المؤتلف في فيروسات هو المختص لتنفيذ، في المختبر، كلا تجهيز ونقل حبلا الأنشطة 3'نهاية يوم خارجيا تزويد LTR مثل الركيزة الحمض النووي. وقد كشفت الدراسات البيوكيميائية باستخدام هذا في المؤتلف النقي الجوانب الهامة من vDNA التكامل 14، 15، 16، 17. ومع ذلك، خلافا لما حدث في العدوى الطبيعية، وهذا في المختبر رد فعل كيميائي حيوي لا يدعم التكامل متضافرة من طرفي DNA الركيزة في الحمض النووي الهدف. في المقابل، بلدان جزر المحيط الهادئ فيروسات المعزولة من الخلايا المصابة تماما تدمج بشكل منسق طرفي vDNA الذاتية إلى مغاير DNA الهدف. وأدى ذلك إلى اعتماد واسع النطاق والتحسينات اللاحقة من أنا ن المختبر التكامل (IVI) فحوصات باستخدام بلدان جزر المحيط الهادئ الأم معزولة.
في أول ذكرت فيروسات IVI فحص وعصائر هيولية من الخلايا المصابة مع الفئران المؤتلففيروس ابيضاض الدم (MLV) ايواء الجين كولاي supF في LTR لها بمثابة مصدر النشاط في، والحمض النووي لفج امدا متحولة تم تزويد خلل في النمو التحللي خارجيا كما الحمض النووي الهدف. التكامل الناجح لالمؤتلف MLV الحمض النووي نسخ في الحمض النووي فج وأدى التعبير التي تلت ذلك supF لاستعادة القدرة على تشكيل اللوحة التذكارية للفاجات المؤتلف. ومع ذلك، فإن هذه الاستراتيجية التجريبية هو التكامل شاقة والتدابير بطريقة غير مباشرة. لمعالجة مثل هذه المحاذير، وضعت على أساس صمة عار الجنوبي غير مباشر نهاية الوسم الفحص، التي تحدد حجم النشاط IVI المرتبطة الموافقة المسبقة عن علم كإجراء من vDNA الذاتية دمجها الخارجية الجراثيم خطي phiX174 الحمض النووي، 6، 7، 18. رغم أن هذا الأسلوب يوفر مقياسا مباشرا لأحداث التكامل، هناك حاجة إلى كميات عالية نسبيا من إعداد الموافقة المسبقة عن علم، التي ما زالت تشكل تحديا تقنياتسعى. للتحايل على هذا، وقد وضعت المتداخلة المقايسات PCR القائم تتطلب كميات محدودة فقط من بلدان جزر المحيط الهادئ 4 و 5 و 19.
في هذا التقرير، وصفنا نسخة محدثة من مقرها-PCR متداخلة في طريقة المختبر وضعت لتلخيص النشاط التكامل بوساطة PIC-HIV-1 التي تحدث أثناء العدوى الطبيعية. يستخدم هذا الأسلوب مقتطفات هيولية من الخلايا المستهدفة المصابة HIV-1 كمصدر من النشاط الذاتية الموافقة المسبقة عن علم، التي تقاس في الوقت الحقيقي البلمرة الكمية سلسلة من ردود الفعل (QPCR). يتم تكييفها إجراءات عزل بلدان جزر المحيط الهادئ وقياس الأنشطة إدماجهم، مع بعض التعديلات، من البروتوكولات نشرت من قبل المختبر Engelman 20. في هذه الطريقة، يتم بدء النشاط التكامل المرتبط الموافقة المسبقة عن علم من خلال توفير هدفا الحمض النووي الخطية دخيلة 21، والمنتجات الحمض النووي الناجم عنويتم تنقية هذا التفاعل التكامل وتستخدم كمادة أولية لالكمي PCR القائم لاحق. في الجولة الأولى PCR التقليدية، وتتضخم الوصلات الحمض النووي الفيروسي الهدف باستخدام بادئات المناسبة. في الدور الثاني QPCR، وتستخدم بادئات LTR محددة لإثراء تحديدا السكان vDNA من الجولة الاولى المنتجات PCR. الرجاء مراجعة القسم بروتوكول للحصول على وصف مفصل لهذا الأسلوب.
في الدراسات المختبرية مع بلدان جزر المحيط الهادئ فيروسات أدت إلى تقدم كبير في فهمنا لآلية التكامل الحمض النووي للفيروسات، وفي تطوير مثبطات IN. وبناء على زيادة التركيز مؤخرا على مواقع التكامل رسم الخرائط HIV-1، وتحديد دور العوامل الفيروسية والمضيف في HIV-1 التكامل، وتطوير الأدوية المضادة للفيروسات جديدة نحو مكافحة مقاومة الأدوية، نتصور اهتماما متزايدا في والاستخدام الواسع النطاق للIVI المقايسات ، مثل تلك المذكورة في هذا التقرير. وهذا، بدوره، يؤدي إلىالتحسينات المستقبلية في طريقة، وبالتالي تنويع نطاق تطبيقاتها.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد وفرت التحليلات الكيميائية الحيوية من بلدان جزر المحيط الهادئ فيروسات الأفكار الهامة في آلية التكامل الحمض النووي للفيروسات. قياس النشاط التكامل بين بلدان جزر المحيط الهادئ فيروسات يمكن تحقيق ذلك عن طريق فحص اللوحة تشكيل، تحليل الجنوبي لطخة، ومتداخلة QPCR. الاستر…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويدعم هذا العمل جزئيا من خلال منح DA024558، DA30896، DA033892، وDA021471 من المعهد الوطني / المعاهد الوطنية للصحة لمؤتمر نزع السلاح. ونحن نعترف أيضا منحة G12MD007586 RCMI، فاندربيلت CTSA منح UL1RR024975، مركز بحوث بالحركة ميهاري (MeTRC) CTSA منحة U54 RR026140 من NCRR / المعاهد الوطنية للصحة، وMD007593 منحة U54 من NIMHD / المعاهد الوطنية للصحة، وتينيسي CFAR منحة P30 AI110527.
Materials
|
Fetal bovine serum (FBS) |
GIBCO/Invitrogen |
10437-028 |
|
Heat-inactivated Fetal bovine serum (Hi-FBS) |
GIBCO/Invitrogen |
10438-026 |
|
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) |
GIBCO/Invitrogen |
11995-065 |
|
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium |
GIBCO/Invitrogen |
11875-093 |
|
Phosphate buffered saline (PBS) (1X) |
GIBCO/Invitrogen |
20012-027 |
|
Trypsin-EDTA (0.25%) |
GIBCO/Invitrogen |
25200-056 |
|
Penicillin-Streptomycin solution (100x) |
Cellgro/Mediatech |
30-002-CI |
|
HEK293T cells (293T) |
American Type Culture Collection (ATCC) |
CRL-3216 |
|
HIV-1 proviral molecular clone pNL4-3 |
NIH AIDS Research and Reference Reagent Program |
114 |
|
PolyFect transfection reagent |
Qiagen |
301107 |
|
DNase |
Calbiochem/Merckmillipore |
260913 |
|
Immulon 2HB 96-well plates |
Thermo Scientific |
3455 |
|
Triton X-100 |
Sigma-Aldrich |
T9284 |
|
ELISA coating antibody: anti-CA-183-H12-5C monoclonal antibody |
NIH AIDS Research and Reference Reagent Program |
1513 |
|
ELISA wash solution (0.2% Tween-20 in PBS) |
— |
— |
|
Donor bovine serum |
Gibco/Invitrogen |
16030074 |
|
Blocking Buffer (5% donor bovine serum in PBS) – Prepare fresh before use. |
— |
— |
|
Sample diluent (SD) buffer (10% donor bovine serum and 0.5% Triton X-100 in PBS) – Sterilize using 0.22 micron pore-size syringe filter and store aliquots at 4°C. |
— |
— |
|
Recombinant p24 protein (Full-length CA protein was expressed from pET21a-CA plasmid in E. coli BL21-DE3 and purified as described in Ref # —-) |
Dr. Wesley Sundquist |
— |
|
HIV IgG |
NIH AIDS Research and Reference Reagent Program |
3957 |
|
Goat anti-human IgG (H+L) cross-adsorbed secondary antibody, HRP conjugate |
Pierce/ThermoFisher |
31412 |
|
TMB Microwell Peroxidase substrate system |
KPL, Inc. |
50-76-00 |
|
SupT1 cells |
American Type Culture Collection (ATCC) |
CRL-1942 |
|
HEPES pH 7.2-7.5 (ready-to-use solution) |
GIBCO/Invitrogen |
15630-080 |
|
Potassium chloride (KCl) solution |
Sigma-Aldrich |
60142 |
|
Magnesium chloride (MgCl2) solution |
Sigma-Aldrich |
M1028 |
|
Dithiothreitol (DTT) |
Sigma-Aldrich |
43815 |
|
Aprotinin |
Sigma-Aldrich |
A6106 |
|
Digitonin |
Sigma-Aldrich |
D141 |
|
RNase A |
Invitrogen |
12091-021 |
|
Sucrose |
Sigma-Aldrich |
S0389 |
|
phiX174 Replicative Form 1 DNA |
Promega |
D1531 |
|
PhiX174-F primer: 5’-CGCTTCCATGACGCAGAAGTT-3’ PhiX174-R primer: 5’-CACTGACCCTCAGCAATCTTA-3’ |
Invitrogen and/or IDT-DNA |
|
|
dNTP mix |
Promega |
U1515 |
|
Go Taq DNA Polymerase |
Promega |
M3005 |
|
Qiaquick gel extraction kit |
Qiagen |
28706 |
|
Ultrapure distilled water |
Invitrogen |
10977-015 |
|
Tris-EDTA (TE) buffer (100X) |
Sigma-Aldrich |
T9285 |
|
Sodium dodecyl sulphate (SDS) |
Sigma-Aldrich |
L3771 |
|
Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt (EDTA) solution, 0.5 M, pH 8.0 |
Sigma-Aldrich |
E7889 |
|
Proteinase K (20 mg/ml ready-to-use solution) |
Qiagen |
19131 |
|
Phenol (equilibrated with 10 mM Tris HCl, pH 8.0 and 1 mM EDTA) |
Sigma-Aldrich |
P4557 |
|
Chloroform |
Sigma-Aldrich |
288306 |
|
Glycogen (5 mg/ml solution) |
Ambion/Invitrogen |
AM9510 |
|
Sodium acetate (3M, pH 5.2) |
Sigma-Aldrich |
57899 |
|
Ethanol |
Sigma-Aldrich |
E7023 |
|
First round LTR primer: 5’-GTGCGCGCTTCAGCAAG-3’) First round phiX174 primer: 5’-CACTGACCCTCAGCAATCTTA-3’ |
Invitrogen and/or IDT-DNA |
— |
|
Second round LTR-R primer: 5’-TCTGGCTAACTAGGGAACCCA-3’ Second round LTR-U primer: 5’-CTGACTAAAAGGGTCTGAGG-3’; Second round Taqman probe: 5’-56– FAM/TTAAGCCTCAATAAAGCTTGC CTTGAGTGC/36-TAMRA/-3’ |
Invitrogen and/or IDT-DNA |
— |
|
iQ Supermix |
Bio-Rad |
170-8862 |
References
- Sattentau, Q. J., Weiss, R. A. The CD4 antigen: physiological ligand and HIV receptor. Cell. 52 (5), 631-633 (1988).
- Wilen, C. B., Tilton, J. C., Doms, R. W. Molecular mechanisms of HIV entry. Adv Exp Med Biol. 726, 223-242 (2012).
- Bowerman, B., Brown, P. O., Bishop, J. M., Varmus, H. E. A nucleoprotein complex mediates the integration of retroviral DNA. Genes Dev. 3 (4), 469-478 (1989).
- Bukrinsky, M. I., Sharova, N., Dempsey, M. P., et al. Active nuclear import of human immunodeficiency virus type 1 preintegration complexes. Proc Natl Acad Sci. 9 (14), 6580-6584 (1992).
- Hansen, M. S., Smith, G. J., Kafri, T., Molteni, V., Siegel, J. S., Bushman, F. D. Integration complexes derived from HIV vectors for rapid assays in vitro. Nature biotechnol. 17 (6), 578-582 (1999).
- Farnet, C. M., Haseltine, W. A. Integration of human immunodeficiency virus type 1 DNA in vitro. Proc Natl Acad Sci. 87 (11), 4164-4168 (1990).
- Fujiwara, T., Mizuuchi, K. Retroviral DNA integration: structure of an integration intermediate. Cell. 54 (4), 497-504 (1988).
- Brown, P. O., Bowerman, B., Varmus, H. E., Bishop, J. M. Correct integration of retroviral DNA in vitro. Cell. 49 (3), 347-356 (1987).
- Lewinski, M. K., Bushman, F. D. Retroviral DNA integration–mechanism and consequences. Adv Genet. 55, 147-181 (2005).
- Engelman, A., Mizuuchi, K., Craigie, R. HIV-1 DNA integration: mechanism of viral DNA cleavage and DNA strand transfer. Cell. 67 (6), 1211-1221 (1991).
- Goff, S. P. Genetics of retroviral integration. Ann rev gen. 26, 527-544 (1992).
- Panganiban, A. T., Temin, H. M. The terminal nucleotides of retrovirus DNA are required for integration but not virus production. Nature. 306 (5939), 155-160 (1983).
- Bieniasz, P. D. The cell biology of HIV-1 virion genesis. Cell host microbe. 5 (6), 550-558 (2009).
- Sherman, P. A., Fyfe, J. A. Human immunodeficiency virus integration protein expressed in Escherichia coli possesses selective DNA cleaving activity. Proc Natl Acad Sci. 87 (13), 5119-5123 (1990).
- Katzman, M., Katz, R. A., Skalka, A. M., Leis, J. The avian retroviral integration protein cleaves the terminal sequences of linear viral DNA at the in vivo sites of integration. J Virol. 63 (12), 5319-5327 (1989).
- Craigie, R., Mizuuchi, K., Bushman, F. D., Engelman, A. A rapid in vitro assay for HIV DNA integration. Nucl acid res. 19 (10), 2729-2734 (1991).
- Bushman, F. D., Craigie, R. Activities of human immunodeficiency virus (HIV) integration protein in vitro: specific cleavage and integration of HIV DNA. Proc Natl Acad Sci. 88 (4), 1339-1343 (1991).
- Pauza, C. D. Two bases are deleted from the termini of HIV-1 linear DNA during integrative recombination. Virology. 179 (2), 886-889 (1990).
- Engelman, A. Isolation and analysis of HIV-1 preintegration complexes. Meth Mol Biol. 485, 135-149 (2009).
- Engelman, A., Oztop, I., Vandegraaff, N., Raghavendra, N. K. Quantitative analysis of HIV-1 preintegration complexes. Methods. 47 (4), 283-290 (2009).
- Addai, A. B., Pandhare, J., Paromov, V., Mantri, C. K., Pratap, S., Dash, C. Cocaine modulates HIV-1 integration in primary CD4+ T cells: implications in HIV-1 pathogenesis in drug-abusing patients. J Leuk Biol. 97 (4), 779-790 (2015).
- Wehrly, K., Chesebro, B. p24 antigen capture assay for quantification of human immunodeficiency virus using readily available inexpensive reagents. Methods. 12 (4), 288-293 (1997).
