Индукция ускоренного атеросклероза у мышей: модель "Wire-Injury"
Summary
Это исследование описывает инвазивную процедуру для индукции ускоренного атеросклероза у мышей. По сравнению с другими методами, использующими электрические или крио-индуцированные травмы, механически-индуцированной травмы имитирует состояние человека restenosis после реваскуляризации терапии и идеально подходит для изучения молекулярных механизмов участие.
Abstract
Атеросклероз является пролиферативным фибро-воспалительным заболеванием, развивающимся в артериальной стенке, вызывая дефицит кровотока или недостаток кровотока. Кроме того, при разрыве дефектной сосудистой стенки атеросклероз вызывает окклюзионное образование тромба, которое является основной причиной инфаркта миокарда или инсульта и наиболее частой причиной смерти. Несмотря на достижения в области сердечно-сосудистой системы, многие вопросы остаются без ответа, и дополнительные фундаментальные исследования необходимы для улучшения нашего понимания молекулярных механизмов во время атеросклероза и его последствий. Из-за ограниченных клинических исследований, существует необходимость в репрезентативных животных моделей воссоздания атеросклеротических условий, таких как образование неоинтимы после имплантации стента, воздушный шар ангиопластики, или эндартерэктомии. Так как мышь представляет много преимуществ и является наиболее часто используемой моделью для изучения молекулярных процессов, текущее исследование предлагает инвазивную процедуру эндотелиальной денуляции, также известную как модель травмы проволоки, которая является репрезентативной человеческого состояния формирования неоинтимы в артериях после процедур реваскуляризации.
Introduction
Атеросклероз является основной патологией, лежащей в основе сердечно-сосудистых событий, таких как инфаркт миокарда или инсульт. Основными механизмами, запускающих острые сердечно-сосудистые синдромы, являются разрыв бляшек, поверхностная эрозия и образование тромбов. Есть несколько клинических ситуаций, связанных с развитием бляшки: родной атеросклеротический налет, рестеноз после эндартерэктомии, и рестеноз после ангиопластики воздушного шара с / без стентовной имплантации1. После артериальной травмы, подавление воспалительных процессов2,3 и восстановление эндотелиального отсека необходимы для предотвращения дальнейших осложнений1. Клинические исследования ограничиваются образцами тканей и крови из-за этических соображений, затрат и отсутствия знаний в базовых механизмах. По этим причинам необходимо изучить молекулярные механизмы в животных моделях4-6,которые могут воссоздать клинические условия. Наша модель ускоренного образования неоинтимы в контексте атеросклероза является результатом многолетнего опыта в реализации этих моделей у мелких животных7-11. Модель мыши является наиболее привлекательной моделью для исследований, из-за его простоты обработки, способность иметь большие группы животных из-за низких затрат, связанных с покупкой и уходом за животными, а также наличие различных трансгенных и нокаут штаммов.
Основным недостатком мыши модели является небольшой размер основных артерий, подверженных атеросклеротической болезни (сонный артерии, аорты, и бедренной артерии), которая требует квалифицированных хирургических знаний и навыков для управления сосудами и инвазивно вызвать атеросклеротические бляшки. Поэтому модель ускоренного формирования неоинтимы, в контексте рестеноза после эндартерэктомии или имплантации стента, предложенная в настоящем документе, представлена пошаговым руководством и предложениями по облегчению введения для заинтересованного персонала. Другим недостатком является то, что денудация производится на нормальной артериальной стенке, и, следовательно, образование нео-интимы будет умеренным по сравнению с клинической ситуацией. Высокий уровень холестерина плазмы, достигнутый в аполипопротеине E нокаутом(Apoe-/-) мышей, питаемых с высоким содержанием жира-диета создает надлежащее провоспалительные среды, необходимые для формирования нео-интима.
Операция проводится под стереомикроскопом. Сонной артерии подвергается средний разрез в брюшной цервикальной области. Анатомические структуры поверх и окружающих сонной артерии минимально манипулируются, чтобы уменьшить послеоперационное воспаление. Обнажается бифуркация сонной артерии. Чтобы вызвать ускоренное образование неоинтимы, внутренние и внешние сонные артерии готовятся к прекращению кровотока и последующей общей денуляции сонной артерии. В заключение, метод может быть изучен персоналом с минимальным опытом в операциях на животных.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этом документе мы предоставляем полезные советы для выполнения процедуры травмы провода даже персоналом с минимальным опытом в операциях на животных. Есть два критических шага в выполнении этой процедуры: разрез внешней сонной артерии и вставки провода. Разрез во внешней сонной артерии должен быть выполнен как можно дальше от бифуркации, для того, чтобы обеспечить достаточно оставшегося материала(Рисунок 1C). Разрез не должен быть слишком большим, из-за риска разрезания всего сосуда. Вторым важным шагом является высокий риск кровотечения во время артериотомии и вставки направляющей проволоки, если кровоток не эффективно прекращено. Кроме того, эндотелиальное денудирование может не иметь место или разрыв артерий возможен, если направляющий провод не будет должным образом введен в сосуде просвета. Чтобы избежать этого, поверхность направляющей проволоки должна быть тщательно отполирована перед операцией.
Для оптимизации протокола положение операционного стола с мышью-головой к хирургу обеспечивает лучшее представление, доступность и контроль для правильной манипуляции проводом. Кроме того, чтобы увеличить воспроизводимость, используйте тот же провод руководства во всех исследованиях. В виду того что размер провода не изменяет, важно рассматривать и исключить все возможные разницы между мышами путем использование такого же пола, времени и веса для всех мышей включенных в изучение. После этого, Эванс-Голубое окрашивание поможет хирургу определить эффективность денуды. Наличие соответствующего оборудования является необходимым условием успеха процедуры. 10X стереомикроскоп имеет важное значение для выполнения этой процедуры. Надлежащая подготовка направляющего провода (например, его полировка) имеет решающее значение. Поэтому мы настоятельно рекомендуем, чтобы подготовка проводов направляющей была выполнена специализированным техническим персоналом там, где это возможно.
В этом протоколе есть много шагов по устранению неполадок. При резвлении внешней сонной артерии вблизи бифуркации, тщательно привязать externa, вблизи бифуркации, так что никаких кровотечений не происходит. Во время резки внешняя соная артерия не видна. Поэтому рассмотрим бифуркацию на уровне шелкового шва. Собирайте секции, когда шелковый шов исчезает. Если разрез во внешней сонной артерии слишком велик и сосуд разрывается, убедитесь, что приток крови в сонную коммуну и внутреннюю сонную артерию эффективно прерывается и попытаться найти отверстие сосуда с помощью щипцов. После введения направляющей проволоки и выполнения денадерации, свяжите сосуд вблизи бифуркации. Во время резки, начинают собирать, когда шелк из шва начинает исчезать. Если артериальный разрыв происходит во время денадерации с помощью направляющей проволоки, проверьте под микроскопом, правильно ли отполирована направляющей проволоки.
Несмотря на сходство модели проволоки травмы клинических ситуаций, многие группы сосредоточены на родной атеросклероз у мышей, или они выбирают инвазивные индукции атеросклероза, такие как воздушный шар ангиопластики у крыс или кроликов, из-за отсутствия квалифицированного персонала, который может выполнять небольшие операции животных. Несмотря на преимущества использования кроликов/крыс, например нет необходимости в миниатюрном оборудовании, ни модели крыс, ни модели кроликов не предлагают различных штаммов нокаута, с точки зрения изучения молекулярных механизмов, участвующих в росте неоинтимы и в стентом тромбозе.
Существующие модели для изучения стентного рестеноза у мышей трудны, требуют высоких хирургических навыков, и имеют высокий риск осложнений, таких как кровотечение или паралич. Например, механическая травма или стент-имплантация в грудную аорту через бедренную артерию сопровождается высоким уровнем смертности (35%) из-за паралича задней ноги или кровотечения13-15. Мы также описываем имплантацию стента в сонную артерию мыши16. Процедура аналогична; однако, обработка тканей для анализа является сложной и не доступна для всех лабораторий16. Сонной артерии непосредственно доступны, не только для операционных процедур, но и для существующих методов визуализации, таких как ультразвуковое изображение. Другие индукции травмы в сонных артериях у мышей может быть сделано с помощью электрических устройств17. Этот метод прост в выполнении и обеспечивает высокую воспроизводимость. Тем не менее, он вызывает травмы во всех слоях судна, который не идентичен механической травмы. Применение воздушных шаров имеет преимущества, например, корректировка диаметра сосуда в соответствии с клинической практикой и оказывает сильное влияние на патологический исход. Несмотря на то, что мыши шары доступны, они очень дорогие и, следовательно, не широко используется. Вместо этого, проволока-травма является установленным методом, имитирующим стент стеноза.
Денудация выполняется на обычной артериальной стенке, хотя и с атеросклеротическим фоном. Таким образом, образование неоинтимы будет умеренным по сравнению с клинической ситуацией. Большое количество доклинических моделей свидетельствует о том, что ни одна из моделей не соответствует всем критериям, необходимым для раскрытия всей клеточной и молекулярной механизмов, ведущих к патофизиологии у людей (см. таблицу 2).
После выполнения процедуры травмы провода, другой биологический и молекулярный анализ может быть выполнен для выявления клеток, белков, мРНК, микроРНК, генов или других биомаркеров, которые могут быть использованы в качестве терапевтических целей для разработки новых стратегий лечения атеросклероза, и, в частности, для формирования неонитимы после сосудистой травмы. При наличии, рост бляшки можно контролировать с помощью высокочастотного ультразвука или других методов визуализации высокого разрешения. Кроме того, освоение этого метода даст оператору возможность адаптировать протокол к другим инвазивным моделям атероссклероза, таким как размещение воротников, частичная перевязка или даже имплантация стента.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Междисциплинарным центром клинических исследований «ИКФ Ахен» (младшая исследовательская группа E.A.L.) на медицинском факультете Университета RWTH Aachen. Мы также благодарим г-жу Рою Солтан за помощь в окрашивания иммуногистохимии.
Materials
| Stereomicroscope | Olympus | SZ/X9 | – |
| Forceps | FST, Germany | 91197-00 | standard tip curved 0,17 mm |
| Hemostat forceps | FST, Germany | 13007-12 | curved |
| Scissors | FST, Germany | 91460-11 | Straight |
| Vannas scissor | Aesculap, Germany | OC 498 R | – |
| Retractors | FST, Germany | 18200-10 | 2.5mm wide |
| Retractors | FST, Germany | 18200-11 | 5mm wide |
| Ketamine 10% | CEVA, Germany | – | – |
| Xylazine 2% | Medistar, Germany | – | – |
| Bepanthene eye and nose cream | Bayer, Germany | – | – |
| Silicon tube | IFK Isofluor, Germany | custom-made product | diameter 500µm, |
| section thickness 100 µm, | |||
| polytetrafluorethylene catheter | |||
| PROLENE Suture 6/0 | ETHICON | 8707H | polypropylene monofilament suture, unresorbable, needle CC-1, 13mm, 3/8 Circle |
| 7/0 Silk | Seraflex | IC 1005171Z | – |
| Michel Suture Clips | FST, Germany | 12040-01 | - |
| Clip Applying Forcep | FST, Germany | 12018-12 | - |
| 14”Wire for Catheter | Abbot | 1000462H | Use 10 cm from stiff part and equalize the ends |
| Mice | Charles River | Apolipoprotein E -/- mice with C57/Bl6 background | - |
References
- Simsekyilmaz, S., Liehn, E. A., Militaru, C., Vogt, F. Progress in interventional cardiology: challenges for the future. Thromb Haemost. 113 (3), 464-472 (2015).
- Kubo, N., McCurdy, S., Boisvert, W. A. Defective Fas Expression on Bone Marrow Derived Cells Alters Atherosclerotic Plaque Morphology in Hyperlipidemic Mice. Discoveries. 3 (1), e37 (2015).
- Saffarzadeh, M., et al. Characterization of rapid neutrophil extracellular trap formation and its cooperation with phagocytosis in human neutrophils. Discoveries. 2 (2), e19 (2014).
- Lindner, V., Fingerle, J., Reidy, M. A. Mouse model of arterial injury. Circ Res. 73 (5), 792-796 (1993).
- Schwartz, R. S., et al. Preclinical evaluation of drug-eluting stents for peripheral applications: recommendations from an expert consensus group. Circulation. 110 (16), 2498-2505 (2004).
- Schwartz, R. S., et al. Restenosis and the proportional neointimal response to coronary artery injury: results in a porcine model. J Am Coll Cardiol. 19 (2), 267-274 (1992).
- Curaj, A., et al. Noninvasive molecular ultrasound monitoring of vessel healing after intravascular surgical procedures in a preclinical setup. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 35 (6), 1366-1373 (2015).
- Liehn, E. A., Schober, A., Weber, C. Blockade of keratinocyte-derived chemokine inhibits endothelial recovery and enhances plaque formation after arterial injury in ApoE-deficient mice. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 24 (10), 1891-1896 (2004).
- Liehn, E. A., Zernecke, A., Postea, O., Weber, C. Chemokines: inflammatory mediators of atherosclerosis. Arch Physiol Biochem. 112 (4-5), 229-238 (2006).
- Simsekyilmaz, S., et al. Role of extracellular RNA in atherosclerotic plaque formation in mice. Circulation. 129 (5), 598-606 (2014).
- Wu, Z., et al. Rhodamine-loaded intercellular adhesion molecule-1-targeted microbubbles for dual-modality imaging under controlled shear stresses. Circ Cardiovasc Imaging. 6 (6), 974-981 (2013).
- Schober, A., et al. Crucial role of the CCL2/CCR2 axis in neointimal hyperplasia after arterial injury in hyperlipidemic mice involves early monocyte recruitment and CCL2 presentation on platelets. Circ Res. 95 (11), 1125-1133 (2004).
- Ali, Z. A., et al. Increased in-stent stenosis in ApoE knockout mice: insights from a novel mouse model of balloon angioplasty and stenting. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 27 (4), 833-840 (2007).
- Chamberlain, J., et al. A novel mouse model of in situ stenting. Cardiovasc Res. 85, 38-44 (2010).
- Rodriguez-Menocal, L., et al. A novel mouse model of in-stent restenosis. Atherosclerosis. 209 (2), 359-366 (2010).
- Simsekyilmaz, S., et al. A murine model of stent implantation in the carotid artery for the study of restenosis. J Vis Exp. , e50233 (2013).
- Schroder, K., et al. NADPH oxidase Nox2 is required for hypoxia-induced mobilization of endothelial progenitor cells. Circ Res. 105 (6), 537-544 (2009).
