Induction de l’athérosclérose accélérée chez les souris : le modèle « Wire-Injury »
Summary
Cette étude décrit une procédure invasive pour l’induction de l’athérosclérose accélérée chez les souris. En comparaison avec d’autres méthodes utilisant des dommages électriques ou cryo-induits, les dommages mécaniques-induits imitent la condition humaine de la restenose après thérapies de revascularisation et est idéale pour l’étude des mécanismes moléculaires impliqués.
Abstract
L’athérosclérose est une maladie fibro-inflammatoire proliférative qui se développe dans la paroi artérielle, induisant un flux sanguin déficient ou un manque de flux sanguin. En outre, par rupture de la paroi vasculaire défectueuse, l’athérosclérose induit la formation de thrombus occlusif, qui représente la cause principale de l’infarctus du myocarde ou de l’AVC et la cause la plus fréquente de décès. Malgré les progrès dans le domaine cardiovasculaire, de nombreuses questions restent sans réponse, et la recherche fondamentale supplémentaire est essentielle pour améliorer notre compréhension des mécanismes moléculaires pendant l’athérosclérose et ses effets. En raison d’études cliniques limitées, il est nécessaire de présenter des modèles animaux représentatifs recréant des affections athérosclérotiques telles que la formation de néointima après l’implantation de stent, l’angioplastie des ballons ou l’endartectomie. Puisque la souris présente de nombreux avantages et est le modèle le plus fréquemment utilisé pour étudier les processus moléculaires, l’étude actuelle propose une procédure invasive de dénudation endothéliale, également connu sous le nom de modèle de lésions filaires, qui est représentatif de la condition humaine de la formation de néointima dans les artères après les procédures de revascularisation.
Introduction
L’athérosclérose est la pathologie principale sous-jacente aux événements cardiovasculaires tels que l’infarctus du myocarde ou l’AVC. Les principaux mécanismes déclenchant des syndromes cardio-vasculaires aigus sont la rupture de plaque, l’érosion superficielle, et la formation de thrombus. Il existe de multiples situations cliniques liées au développement de la plaque : plaque athérosclérotique indigène, resténose après endartectomie, et resténose après angioplastie de ballon avec/sans implantation de stent1. Après une lésion artérielle, la suppression des processus inflammatoires2,3 et la récupération du compartiment endothélial sont essentiels pour prévenir d’autres complications1. La recherche clinique est limitée aux échantillons de tissus et de sang en raison de considérations éthiques, des coûts et d’un manque de connaissances dans les mécanismes de base. Pour ces raisons, il est nécessaire d’étudier les mécanismes moléculaires dans les modèles animaux4-6, qui peuvent recréer les conditions cliniques. Notre modèle de formation accélérée de néointima dans le contexte de l’athérosclérose est le résultat de nombreuses années d’expérience dans la mise en œuvre de ces modèles chez les petits animaux7-11. Le modèle de souris est le modèle le plus attrayant pour la recherche, en raison de sa facilité de manipulation, la capacité d’avoir de grands groupes d’animaux en raison de faibles coûts liés à l’achat et les soins des animaux, et la disponibilité de diverses souches transgéniques et knock-out.
Le principal inconvénient du modèle de souris est la petite taille des artères principales soumises à la maladie athérosclérotique (l’artère carotide, l’aorte, et l’artère fémorale), qui exige une expertise chirurgicale qualifiée et des compétences pour manipuler les vaisseaux et d’induire invasivement une plaque athérosclérotique. Par conséquent, le modèle de formation accélérée de néointima, dans le contexte de la restenosectomie après l’implantation d’endartectomie ou de stent, proposé dans ce document est présenté avec une ligne directrice étape par étape et des suggestions pour faciliter l’introduction pour le personnel intéressé. Un autre inconvénient est que la dénudation est faite sur la paroi artérielle normale, et donc, la formation néo-ittima sera modérée par rapport à la situation clinique. Le niveau élevé de cholestérol plasmatique atteint chez les souris apolipoprotéines E knockout (Apoe-/-) nourris avec un régime riche en matières grasses crée un environnement pro-inflammatoire approprié nécessaire à la formation néo-intima.
La chirurgie est effectuée sous un stéréomicroscope. L’artère carotide est exposée par une incision médiane dans la région cervicale ventrale. Les structures anatomiques au-dessus et entourant l’artère carotide sont minimalement manipulées pour réduire l’inflammation post-chirurgicale. La bifurcation de l’artère carotide est exposée. Pour induire la formation accélérée de neointima, les artères carotides internes et externes sont préparées pour l’arrêt de flux sanguin et la dénudation commune suivante d’artère carotide. En conclusion, la méthode peut être apprise par le personnel ayant une expérience minimale dans les chirurgies animales.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans cet article, nous fournissons des conseils utiles pour effectuer la procédure de blessure de fil, même par le personnel avec une expérience minimale dans les chirurgies animales. Il y a deux étapes critiques dans l’exécution de cette procédure : l’incision de l’artère carotide externe et l’insertion du fil. L’incision dans l’artère carotide externe doit être effectuée dans la mesure du possible de la bifurcation, afin d’assurer suffisamment de matériaux restants (Figure 1C). L’incision ne doit pas être trop grande, en raison du risque de coupe de l’ensemble du navire. La deuxième étape critique est le risque élevé de saignement pendant l’artériotomie et l’insertion du fil de guidage si le flux sanguin n’est pas efficacement interrompu. De plus, la dénuderation endothéliale pourrait ne pas avoir lieu ou une rupture artérielle est possible si le fil de guidage n’est pas correctement introduit dans le récipient de lumen. Pour éviter cela, la surface du fil de guidage doit être soigneusement polie avant l’opération.
Pour optimiser le protocole, la position de la table d’opération avec la tête de souris vers le chirurgien assure une meilleure vue, l’accessibilité et le contrôle pour la manipulation appropriée de fil de guidage. En outre, pour augmenter la reproductibilité, utilisez le même fil de guidage dans toutes les études. Comme la taille du fil ne change pas, il est important d’examiner et d’éliminer toutes les différences possibles entre les souris en utilisant le même sexe, l’âge et le même poids pour toutes les souris incluses dans une étude. Par la suite, la coloration Evans-Blue aidera le chirurgien à déterminer l’efficacité de la dénudation. L’existence d’équipements appropriés est une condition préalable au succès de la procédure. Un stéréomicroscope 10X est essentiel pour effectuer cette procédure. La bonne préparation du fil de guidage (par exemple le polir) est cruciale. Par conséquent, nous recommandons fortement que la préparation du fil de guidage soit effectuée par du personnel technique spécialisé, le cas échéant.
Il existe de nombreuses étapes de dépannage dans ce protocole. Si incising l’artère carotide externe près de la bifurcation, lier soigneusement l’externa, près de la bifurcation, de sorte qu’aucun saignement ne se produit. Pendant la coupe, l’artère carotide externe ne peut pas être vu. Par conséquent, considérez la bifurcation au niveau de la suture de soie. Recueillir les sections lorsque la suture de soie disparaît. Si l’incision dans l’artère carotide externe est trop grande et que le vaisseau est rompu, assurez-vous que le flux sanguin dans la communauté carotide et l’artère carotide interne est effectivement interrompu et essayez de trouver l’ouverture du vaisseau à l’aide de forceps. Après avoir introduit le fil de guidage et effectué la dénature, lier le navire près de la bifurcation. Pendant la coupe, commencer à recueillir lorsque la soie de la suture commence à disparaître. Si la rupture artérielle se produit pendant la dénudation avec le fil de guidage, vérifiez sous le microscope si le fil de guidage est correctement poli.
Malgré la similitude du modèle de lésions filaires avec les situations cliniques, de nombreux groupes se concentrent sur l’athérosclérose indigène chez les souris, ou ils choisissent des inductions invasives d’athérosclérose, telles que l’angioplastie de ballon chez les rats ou les lapins, en raison du manque de personnel formé qui peut effectuer de petites chirurgies animales. Malgré les avantages de l’utilisation de lapins/rats, par exemple pas besoin d’équipement miniaturisé, ni les modèles de rat ni les modèles de lapin n’offrent une variété de souches knock-out différentes, en termes d’étude des mécanismes moléculaires impliqués dans la croissance du néointima et la thrombose en stent.
Les modèles existants pour étudier la restenose en stent chez la souris sont difficiles, nécessitent des compétences chirurgicales élevées, et ont des risques élevés de complications telles que des saignements ou une paralysie. Par exemple, la blessure mécanique ou l’implantation de stent dans l’aorte thoracique par l’artère fémorale est accompagnée d’un taux de mortalité élevé (35%) en raison d’une paralysie de la jambe arrière ou d’un saignement13-15. Nous décrivons également l’implantation de stent dans l’artère carotide d’une souris16. La procédure est similaire; toutefois, le traitement des tissus pour analyse est compliqué et n’est pas disponible pour tous les laboratoires16. L’artère carotide est directement accessible, non seulement pour les procédures d’opération, mais aussi pour les méthodes d’imagerie existantes telles que l’imagerie par ultrasons. D’autres inductions de blessures dans les artères carotides chez les souris peuvent être faites à l’aide de dispositifs électriques17. Cette méthode est facile à exécuter et assure une reproductibilité élevée. Cependant, il provoque des blessures dans toutes les couches du navire, ce qui n’est pas identique à une blessure mécanique. Les applications de ballon ont des avantages, par exemple l’ajustement au diamètre du navire en conformité avec la pratique clinique et a une forte influence sur les résultats pathologiques. Même si les ballons de souris sont disponibles, ils sont très chers et donc, pas largement utilisé. Au lieu de cela, le fil-blessure est la méthode établie, imitant la sténose en stent.
La dénudation est exécutée sur la paroi artérielle normale, bien qu’avec un fond athérosclérotique. Par conséquent, la formation de neointima sera modérée par rapport à la situation clinique. Le nombre élevé de modèles précliniques démontre qu’aucun des modèles ne répond à tous les critères nécessaires pour découvrir l’ensemble des mécanismes cellulaires et moléculaires menant à la pathophysiologie chez l’homme (voir tableau 2).
Après avoir effectué la procédure de lésion filaire, d’autres analyses biologiques et moléculaires peuvent être effectuées pour identifier les cellules, les protéines, les ARNm, les microARN, les gènes ou d’autres biomarqueurs, qui peuvent être utilisés comme cibles thérapeutiques pour développer de nouvelles stratégies de traitement de l’athérosclérose, et en particulier pour la formation de néointimas après une lésion vasculaire. Si disponible, la croissance de la plaque peut être surveillée à l’aide d’ultrasons à haute fréquence ou d’autres techniques d’imagerie haute résolution. De plus, la maîtrise de cette technique donnerait à l’opérateur la possibilité d’adapter le protocole à d’autres modèles invasifs d’incitation à l’athérosclérose, tels que le placement du collier, la ligature partielle ou même l’implantation de stent.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par le Centre interdisciplinaire de recherche clinique IZKF Aix-la-Chapelle (groupe de recherche junior à E.A.L.) au sein de la faculté de médecine de l’Université RWTH d’Aix-la-Chapelle. Nous remercions également Mme Roya Soltan pour son aide pour la coloration de l’immunohistorique.
Materials
| Stereomicroscope | Olympus | SZ/X9 | – |
| Forceps | FST, Germany | 91197-00 | standard tip curved 0,17 mm |
| Hemostat forceps | FST, Germany | 13007-12 | curved |
| Scissors | FST, Germany | 91460-11 | Straight |
| Vannas scissor | Aesculap, Germany | OC 498 R | – |
| Retractors | FST, Germany | 18200-10 | 2.5mm wide |
| Retractors | FST, Germany | 18200-11 | 5mm wide |
| Ketamine 10% | CEVA, Germany | – | – |
| Xylazine 2% | Medistar, Germany | – | – |
| Bepanthene eye and nose cream | Bayer, Germany | – | – |
| Silicon tube | IFK Isofluor, Germany | custom-made product | diameter 500µm, |
| section thickness 100 µm, | |||
| polytetrafluorethylene catheter | |||
| PROLENE Suture 6/0 | ETHICON | 8707H | polypropylene monofilament suture, unresorbable, needle CC-1, 13mm, 3/8 Circle |
| 7/0 Silk | Seraflex | IC 1005171Z | – |
| Michel Suture Clips | FST, Germany | 12040-01 | - |
| Clip Applying Forcep | FST, Germany | 12018-12 | - |
| 14”Wire for Catheter | Abbot | 1000462H | Use 10 cm from stiff part and equalize the ends |
| Mice | Charles River | Apolipoprotein E -/- mice with C57/Bl6 background | - |
References
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