Indução de Aterosclerose Acelerada em Camundongos: O Modelo de "Lesão por Fio"
Summary
Este estudo descreve um procedimento invasivo para a indução de aterosclerose acelerada em camundongos. Em comparação com outros métodos que utilizam lesões elétricas ou induzidas por criodes, a lesão induzida por mecânica imita a condição humana da restenose após terapias de revascularização e é ideal para o estudo dos mecanismos moleculares envolvidos.
Abstract
A aterosclerose é uma doença fibro-inflamatória proliferativa que se desenvolve na parede arterial, induzindo um fluxo sanguíneo deficiente ou falta de fluxo sanguíneo. Além disso, pela ruptura da parede vascular defeituosa, a aterosclerose induz a formação de trombos oclusivos, o que representa a principal causa de infarto ou derrame do miocárdio e a causa mais frequente de morte. Apesar dos avanços no campo cardiovascular, muitas perguntas permanecem sem resposta, e pesquisas básicas adicionais são essenciais para melhorar nossa compreensão dos mecanismos moleculares durante a aterosclerose e seus efeitos. Devido a estudos clínicos limitados, há necessidade de modelos animais representativos recriando condições ateroscleróticas, como a formação de neointima após implantação de stent, angioplastia de balão ou endarterectomia. Como o camundongo apresenta muitas vantagens e é o modelo mais utilizado para o estudo de processos moleculares, o presente estudo propõe um procedimento invasivo de desnudação endotelial, também conhecido como modelo de lesão de fio, que é representativo da condição humana de formação de neointima nas artérias após procedimentos de revascularização.
Introduction
A aterosclerose é a principal patologia subjacente a eventos cardiovasculares, como infarto do miocárdio ou derrame. Os principais mecanismos que desencadeiam síndromes cardiovasculares agudas são ruptura de placa, erosão superficial e formação de trombos. Existem múltiplas situações clínicas ligadas ao desenvolvimento da placa: placa aterosclerótica nativa, restenose após endarterectomia e restenose após angioplastia de balão com/sem implante de stent1. Após lesão arterial, a supressão dos processos inflamatórios2,3 e a recuperação do compartimento endotelial são essenciais para evitar novas complicações1. A pesquisa clínica limita-se a amostras de tecidos e sangue devido a considerações éticas, custos e falta de conhecimento em mecanismos básicos. Por essas razões, é necessário estudar mecanismos moleculares nos modelos animais4-6, que podem recriar as condições clínicas. Nosso modelo de formação acelerada de neointima no contexto da aterosclerose é resultado de muitos anos de experiência na implementação desses modelos em pequenos animais7-11. O modelo de camundongos é o modelo mais atrativo para a pesquisa, devido à sua facilidade de manuseio, à capacidade de ter grandes grupos animais devido aos baixos custos relacionados à compra e cuidado animal, e à disponibilidade de várias cepas transgênicas e eliminatórias.
A maior desvantagem do modelo de camundongos é o pequeno tamanho das artérias principais submetidas à doença aterosclerótica (a artéria carótida, a aorta e a artéria femoral), que requer conhecimentos cirúrgicos qualificados e habilidades para manipular os vasos e induzir invasivamente uma placa aterosclerótica. Portanto, o modelo de formação acelerada de neointima, no contexto de restenose após a endarterectomia ou implantação de stent, proposto neste artigo é apresentado com uma diretriz passo a passo e sugestões para facilitar a introdução para o pessoal interessado. Outra desvantagem é que a desnudação é feita na parede arterial normal e, portanto, a formação neo-intima será moderada em comparação com a situação clínica. O alto nível de colesterol plasmético alcançado em apolipoproteína E nocaute(Apoe-/-) camundongos alimentados com uma dieta rica em gordura cria um ambiente pró-inflamatório adequado necessário para a formação neo-intima.
A cirurgia é realizada sob um estereótipo. A artéria carótida é exposta por uma incisão mediana na área cervical ventral. Estruturas anatômicas em cima e ao redor da artéria carótida são minimamente manipuladas para reduzir a inflamação pós-cirúrgica. A bifurcação da artéria carótida está exposta. Para induzir a formação acelerada de neointima, artérias carótidas internas e externas são preparadas para a cessação do fluxo sanguíneo e posterior desnudação da artéria carótida comum. Em conclusão, o método pode ser aprendido por pessoas com experiência mínima em cirurgias animais.
Protocol
Representative Results
Discussion
Neste artigo, fornecemos dicas úteis para realizar o procedimento de lesão por fio até mesmo por pessoas com experiência mínima em cirurgias animais. Existem duas etapas críticas na realização deste procedimento: a incisão da artéria carótida externa e a inserção do fio. A incisão na artéria carótida externa precisa ser realizada o mais longe possível da bifurcação, a fim de garantir material suficiente restante(Figura 1C). A incisão não deve ser muito grande, devido ao risco de cortar toda a embarcação. O segundo passo crítico é o alto risco de sangramento durante a arteriotomia e a inserção do fio-guia se o fluxo sanguíneo não for eficientemente descontinuado. Além disso, a denudação endotelial pode não ocorrer ou a ruptura arterial é possível se o fio guia não for introduzido adequadamente no vaso de lúmen. Para evitar isso, a superfície do fio-guia deve ser cuidadosamente polida antes da operação.
Para otimizar o protocolo, a posição da mesa de operação com o mouse-head em direção ao cirurgião garante uma melhor visão, acessibilidade e controle para a manipulação adequada do fio guia. Além disso, para aumentar a reprodutibilidade, use o mesmo fio-guia em todos os estudos. Como o tamanho do fio não muda, é importante considerar e eliminar todas as possíveis diferenças entre os camundongos usando o mesmo sexo, idade e peso para todos os camundongos incluídos em um estudo. Depois disso, a coloração Evans-Blue ajudará o cirurgião a determinar a eficiência da desnudação. A existência de equipamentos adequados é um pré-requisito para o sucesso do procedimento. Um estereómico 10X é essencial para a realização deste procedimento. A preparação adequada do fio-guia (por exemplo, polimento) é crucial. Por isso, recomendamos fortemente que a preparação do fio guia seja realizada por pessoal técnico especializado quando disponível.
Há muitas etapas de solução de problemas neste protocolo. Se incisar a artéria carótida externa perto da bifurcação, amarre cuidadosamente a externa, perto da bifurcação, para que não ocorra sangramento. Durante o corte, a artéria carótida externa não pode ser vista. Portanto, considere a bifurcação ao nível da sutura de seda. Colete seções quando a sutura de seda desaparecer. Se a incisão na artéria carótida externa for muito grande e o vaso for rompido, certifique-se de que o fluxo sanguíneo para a comuna carótida e artéria carótida interna seja efetivamente interrompido e tente encontrar a abertura do vaso usando fórceps. Depois de introduzir o fio guia e realizar a desnudação, amarre o vaso perto da bifurcação. Durante o corte, comece a coletar quando a seda da sutura começar a desaparecer. Se ocorrer ruptura arterial durante a desnudação com o fio-guia, verifique sob o microscópio se o fio guia está devidamente polido.
Apesar da semelhança do modelo de lesão de arame com situações clínicas, muitos grupos estão focados na aterosclerose nativa em camundongos, ou escolhem induções invasivas de aterosclerose, como angioplastia de balão em ratos ou coelhos, devido à falta de pessoal treinado que possa realizar pequenas cirurgias animais. Apesar dos benefícios do uso de coelhos/ratos, por exemplo, não há necessidade de equipamentos miniaturizados, nem modelos de ratos nem de coelhos oferecem uma variedade de diferentes cepas de knock-out, em termos de estudo de mecanismos moleculares envolvidos no crescimento de neointima e trombose de stent.
Os modelos existentes para estudar restenose de stent em camundongos são difíceis, requerem altas habilidades cirúrgicas e têm altos riscos de complicações, como sangramento ou paralisia. Por exemplo, a lesão mecânica ou implantação de stent na aorta torácica via artéria femoral é acompanhada por uma alta taxa de mortalidade (35%) devido à paralisia da perna traseira ou sangramento13-15. Também descrevemos a implantação de stent na artéria carótida de um rato16. O procedimento é semelhante; no entanto, o processamento de tecidos para análise é complicado e não está disponível para todos os laboratórios16. A artéria carótida é diretamente acessível, não apenas para procedimentos de operação, mas também para métodos de imagem existentes, como a imagem de ultrassom. Outras induções de lesões nas artérias carótidas em camundongos podem ser feitas usando dispositivos elétricos17. Este método é fácil de executar e garante alta reprodutibilidade. No entanto, induz lesões em todas as camadas do vaso, que não é idêntica com lesão mecânica. As aplicações de balões têm benefícios, por exemplo, o ajuste ao diâmetro do vaso em consonância com a prática clínica e tem forte influência no desfecho patológico. Embora os balões de rato estejam disponíveis, eles são muito caros e, portanto, não são amplamente utilizados. Em vez disso, a lesão do fio é o método estabelecido, imitando estenose in-stent.
A desnudação é realizada na parede arterial normal, embora com um fundo aterosclerótico. Portanto, a formação de neointima será moderada em relação à situação clínica. O alto número de modelos pré-clínicos demonstra que nenhum dos modelos preenche todos os critérios necessários para descobrir a totalidade dos mecanismos celulares e moleculares que levam à fisiopatologia em humanos (ver Tabela 2).
Após a realização do procedimento de lesão por fio, outras análises biológicas e moleculares podem ser realizadas para identificar células, proteínas, mRNAs, microRNAs, genes ou outros biomarcadores, que podem ser usados como alvos terapêuticos para desenvolver novas estratégias de tratamento para aterosclerose, e em particular para a formação de neointima após lesão vascular. Se disponível, o crescimento da placa pode ser monitorado usando ultrassom de alta frequência ou outras técnicas de imagem de alta resolução. Além disso, dominar essa técnica daria ao operador a oportunidade de adaptar o protocolo a outros modelos invasivos de incentivo à aterosclerose, como colocação de coleira, ligadura parcial ou até mesmo implantação de stent.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelo Centro Interdisciplinar de Pesquisa Clínica IZKF Aachen (grupo de pesquisa júnior da E.A.L.) dentro da faculdade de Medicina da Universidade RWTH Aachen. Agradecemos também à Sra. Roya Soltan pela ajuda com a mancha imunohistoquímica.
Materials
| Stereomicroscope | Olympus | SZ/X9 | – |
| Forceps | FST, Germany | 91197-00 | standard tip curved 0,17 mm |
| Hemostat forceps | FST, Germany | 13007-12 | curved |
| Scissors | FST, Germany | 91460-11 | Straight |
| Vannas scissor | Aesculap, Germany | OC 498 R | – |
| Retractors | FST, Germany | 18200-10 | 2.5mm wide |
| Retractors | FST, Germany | 18200-11 | 5mm wide |
| Ketamine 10% | CEVA, Germany | – | – |
| Xylazine 2% | Medistar, Germany | – | – |
| Bepanthene eye and nose cream | Bayer, Germany | – | – |
| Silicon tube | IFK Isofluor, Germany | custom-made product | diameter 500µm, |
| section thickness 100 µm, | |||
| polytetrafluorethylene catheter | |||
| PROLENE Suture 6/0 | ETHICON | 8707H | polypropylene monofilament suture, unresorbable, needle CC-1, 13mm, 3/8 Circle |
| 7/0 Silk | Seraflex | IC 1005171Z | – |
| Michel Suture Clips | FST, Germany | 12040-01 | - |
| Clip Applying Forcep | FST, Germany | 12018-12 | - |
| 14”Wire for Catheter | Abbot | 1000462H | Use 10 cm from stiff part and equalize the ends |
| Mice | Charles River | Apolipoprotein E -/- mice with C57/Bl6 background | - |
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