マウスにおける加速アテローム性動脈硬化症の誘導:ワイヤー傷害モデル
Summary
本研究は、マウスにおける加速アテローム性動脈硬化の誘導のための侵襲的処置を説明する。電気またはクライオによる傷害を用いた他の方法と比較して、機械的誘発傷害は、再血管化療法後の修復の人間の状態を模倣し、関係する分子機構の研究に理想的である。
Abstract
アテローム性動脈硬化症は、動脈壁に発症する増殖性線維炎症性疾患であり、血流の不足または血流の欠如を誘発する。さらに、欠陥血管壁の破裂により、アテローム性動脈硬化症は、心筋梗塞または脳卒中の主な原因および最も頻繁な死因を表す閉塞性血栓形成を誘導する。心血管分野の進歩にもかかわらず、多くの疑問は未回答のままであり、アテローム性動脈硬化症の分子メカニズムとその効果についての理解を深めるためには、追加の基礎研究が不可欠です。限られた臨床研究のために、ステント移植、バルーン血管形成術、または内動脈切除術後のネオインティマ形成などの動脈硬化状態を再現する代表的な動物モデルが必要である。マウスは多くの利点を提示し、分子プロセスを研究するための最も頻繁に使用されるモデルであるため、現在の研究は、再血管化手順後の動脈における新内皮形成の人間の状態を代表する内皮性脱細モデルとしても知られている内皮性脱細の侵襲的処置を提案している。
Introduction
アテローム性動脈硬化症は心筋梗塞や脳卒中などの心血管イベントの根底にある主な病理である。急性心血管症候群を引き起こす主なメカニズムは、プラーク破裂、表面浸食、血栓形成である。プラークの発達に関連する複数の臨床状況があります:ネイティブアテローム硬化性プラーク、内動脈摘出後のレステノーシス、およびステント移植を伴う/無しのバルーン血管形成術後のレステノーシス1。動脈損傷後、炎症過程2,3 の抑制と内皮区画の回復は、さらなる合併症1を予防するために不可欠である。臨床研究は、倫理的な配慮、コスト、および基本的なメカニズムの知識の欠如のために組織および血液サンプルに限定されています。これらの理由から、臨床状態を再現できる動物モデル4-6の分子機構を研究する必要があります。アテローム性動脈硬化症の文脈における加速ネオインティマ形成の私達のモデルは、小動物7-11でこれらのモデルの実施における長年の経験の結果である。マウスモデルは、取り扱いの容易さ、動物の購入とケアに関連する低コストによる大型動物群を持つ能力、および様々なトランスジェニックおよびノックアウト株の可用性のために、研究のための最も魅力的なモデルです。
マウスモデルの主な欠点は、動脈硬化性疾患(頸動脈、大動脈、大腿動脈)を受けた主動脈の小さなサイズであり、血管を操作し、アテローム硬化性プラークを侵襲するために有資格の外科的専門知識とスキルを必要とする。そこで、加速ネオインティマ形成のモデルは、内動脈切除術またはステント移植後の残り口の文脈において、本論文で提案される、関心のある人材の導入を容易にするための段階的なガイドラインおよび提案を提示する。もう一つの欠点は、正常な動脈壁に脱潤がなされることであり、したがって、ネオインティマ形成は臨床状況と比較して中程度になることである。アポリポプロテインEノックアウト(Apoe-/-)マウスに高脂肪食を与えた高レベルの血漿コレステロールは、ネオインティマ形成に必要な適切な炎症促進環境を作り出す。
手術は実体顕微鏡で行われる。頸動脈は、腹側頸部領域の中央部切開によって露出される。頸動脈の上および周囲の解剖学的構造は、手術後の炎症を軽減するために最小限に操作される。頸動脈分岐が露出している。加速ネオインティマ形成を誘導するために、内部および外部の頸動脈は血流停止およびそれに続く一般的な頸動脈の脱潤のために準備される。結論として、この方法は、動物の手術における最小限の経験を持つ人員によって学ぶことができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
本論文では、動物の手術経験が少ない人でも、ワイヤー傷害処置を行う上で有用なヒントを提供する。この手順を実行する上で重要な手順は、外的頸動脈の切開とワイヤーの挿入の 2 つの重要なステップです。外的頸動脈の切開は、十分な残りの材料を確保するために、分岐から可能な限り行われる必要がある(図1C)。切開は、容器全体を切断するリスクがあるため、大きすぎないようにしてください。第2の重要なステップは、血流が効率的に中止されない場合、動脈切開術中の出血のリスクが高く、ガイドワイヤーが挿入されないことです。また、内皮性内膜が起きない場合や、管腔内にガイドワイヤーが適切に導入されない場合は動脈破裂が起こる可能性があります。これを避けるために、ガイドワイヤーの表面は操作の前に注意深く磨かれなければならない。
プロトコルを最適化するために、外科医に向かってマウスヘッドを持つ手術台の位置は、適切なガイドワイヤ操作のためのより良いビュー、アクセシビリティと制御を保証します。また、再現性を高めるには、全ての研究で同じガイドワイヤーを使用する。ワイヤーサイズは変化しないので、研究に含まれるすべてのマウスに対して同じ性別、年齢、体重を使用して、マウス間の考えられるすべての違いを考慮し、排除することが重要です。その後、エバンス-ブルー染色は、外科医が脱潤の効率を決定するのに役立ちます。適切な機器の存在は、手順の成功のための前提条件です。この手順を実行するには、10倍の実体顕微鏡が不可欠です。ガイドワイヤーの適切な準備(例えば研磨)は非常に重要です。そのため、ガイドワイヤーの準備は、専門の技術担当者が可能な場合には行うことを強くお勧めします。
このプロトコルには多くのトラブルシューティング手順があります。分岐の近くに外頸動脈を切開する場合は、分岐の近くにエクステルナを慎重に結合するので、出血は起こらない。切断中、外的頸動脈が見えない。従って、絹縫合のレベルでの分岐を考える。シルクの縫合糸が消えたら、セクションを集める。外頸動脈の切開が大きすぎて血管が破裂した場合は、頸動脈コミュニスおよび内部頸動脈への血流が効果的に中断されることを確認し、鉗子を使用して血管の開口部を見つけようとします。ガイドワイヤーを導入し、否定を行った後、分岐の近くに容器を結合する。切断中に、縫合糸から絹が消え始めたときに収集を開始します。ガイドワイヤーで歯の引き出し中に動脈破裂が起こった場合は、ガイドワイヤーが適切に研磨されているかどうかを顕微鏡で確認してください。
ワイヤー傷害モデルと臨床状況の類似性にもかかわらず、多くのグループはマウスの在来アテローム性動脈硬化症に焦点を当てているか、小さな動物手術を行うことができる訓練を受けた人員がいないため、ラットやウサギのバルーン血管形成術などの侵襲的なアテローム性動脈硬化症誘導を選択する。ウサギ/ラットを使用する利点にもかかわらず、 例えば 、小型化された装置の必要性がない、ラットモデルもウサギモデルも、ネオインティマの成長とステント血栓症に関与する分子メカニズムを研究するという点で、様々なノックアウト株を提供しない。
マウスのステント内修復を研究するための既存のモデルは困難であり、高い外科的スキルを必要とし、出血や麻痺などの合併症のリスクが高い。例えば、大腿動脈を介した胸部大動脈への機械的損傷またはステント移植は、高い死亡率(35%)を伴う後肢麻痺または出血による 13-15.我々はまた、マウス16の頸動脈におけるステント移植について述べている。手順は似ています。しかし、分析のための組織処理は複雑であり、すべての実験室16で利用できるわけではありません。頸動脈は、手術手順のためだけでなく、超音波画像処理などの既存の画像化方法にも直接アクセス可能である。マウスにおける頸動脈における他の傷害誘導は、電気デバイス17を用いて行うことができる。この方法は、実行が容易であり、高い再現性を保証します。しかし、それはすべての血管層に傷害を誘発し、機械的損傷と同一ではない。バルーンアプリケーションには、 例えば 臨床実践に沿った血管径の調整が利点を有し、病理学的結果に強い影響を与えます。マウス風船は利用可能ですが、それらは非常に高価であり、したがって、広く使用されていません。代わりに、ワイヤー傷害は確立された方法であり、狭窄を模倣する。
脱潤は、アテローム硬化性の背景を有するが、正常な動脈壁に行われる。したがって、ネオインティマ形成は臨床状況に比べて中程度となる。前臨床モデルの数が多いのは、ヒトの病態生理学につながる細胞および分子メカニズムの全体を明らかにするために必要な基準をすべて満たすモデルがいずれもいなさることを示している( 表2参照)。
ワイヤー傷害手順を行った後、他の生物学的および分子的分析は、細胞、タンパク質、mRNA、マイクロRNA、遺伝子または他のバイオマーカーを同定するために行うことができるが、これはアテローム性動脈硬化症の新しい治療戦略を開発するために、特に血管損傷後の新内皮形成に対する治療標的として使用することができる。利用可能であれば、プラークの成長は、高周波超音波または他の高解像度画像技術を使用して監視することができる。さらに、この技術を習得することで、オペレータは、カラー配置、部分ライゲーション、ステント注入などの他の侵襲的なアテローム性動脈硬化症誘導モデルにプロトコルを適応させる機会を与える。
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、RWTHアーヘン大学医学部内のIZKFアーヘン(E.A.L.のジュニア研究グループ)の学際的な研究センターによって支援されました。また、ロヤ・ソルタン夫人の免疫検査染色に対する助けに感謝します。
Materials
| Stereomicroscope | Olympus | SZ/X9 | – |
| Forceps | FST, Germany | 91197-00 | standard tip curved 0,17 mm |
| Hemostat forceps | FST, Germany | 13007-12 | curved |
| Scissors | FST, Germany | 91460-11 | Straight |
| Vannas scissor | Aesculap, Germany | OC 498 R | – |
| Retractors | FST, Germany | 18200-10 | 2.5mm wide |
| Retractors | FST, Germany | 18200-11 | 5mm wide |
| Ketamine 10% | CEVA, Germany | – | – |
| Xylazine 2% | Medistar, Germany | – | – |
| Bepanthene eye and nose cream | Bayer, Germany | – | – |
| Silicon tube | IFK Isofluor, Germany | custom-made product | diameter 500µm, |
| section thickness 100 µm, | |||
| polytetrafluorethylene catheter | |||
| PROLENE Suture 6/0 | ETHICON | 8707H | polypropylene monofilament suture, unresorbable, needle CC-1, 13mm, 3/8 Circle |
| 7/0 Silk | Seraflex | IC 1005171Z | – |
| Michel Suture Clips | FST, Germany | 12040-01 | - |
| Clip Applying Forcep | FST, Germany | 12018-12 | - |
| 14”Wire for Catheter | Abbot | 1000462H | Use 10 cm from stiff part and equalize the ends |
| Mice | Charles River | Apolipoprotein E -/- mice with C57/Bl6 background | - |
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