في الموقع وصفها من الحمض النووي النسخ المتماثل في ذبابة الفاكهة الكبار المبايض عن طريق ايدو تلطيخ
Summary
Drosophila oogenesis continues to be exceptionally useful in the study of mitochondrial proliferation and inheritance. This manuscript describes a detailed protocol used to label the replicating mitochondrial DNA (mtDNA) in Drosophila adult ovaries with 5-ethynyl-2´-deoxyuridine (EdU), which facilitates uncovering mechanisms associated with mitochondrial inheritance that were previously debatable.
Abstract
The mitochondrial genome is inherited exclusively through the maternal line. Understanding of how the mitochondrion and its genome are proliferated and transmitted from one generation to the next through the female oocyte is of fundamental importance. Because of the genetic tractability, and the elegant, ordered simplicity by which oocyte development proceeds, Drosophila oogenesis has become an invaluable system for mitochondrial study. An EdU (5-ethynyl-2´-deoxyuridine) labeling method was utilized to detect mitochondrial DNA (mtDNA) replication in Drosophila ovaries. This method is superior to the BrdU (5-bromo-2′-deoxyuridine) labeling method in that it allows for good structural preservation and efficient fluorescent dye penetration of whole-mount tissues.
Here we describe a detailed protocol for labeling replicating mitochondrial DNA in Drosophila adult ovaries with EdU. Some technical solutions are offered to improve the viability of the ovaries, maintain their health during preparation, and ensure high-quality imaging. Visualization of newly synthesized mtDNA in the ovaries not only reveals the striking temporal and spatial pattern of mtDNA replication through oogenesis, but also allows for simple quantification of mtDNA replication under various genetic and pharmacological perturbations.
Introduction
إلى جانب الجينوم النووي، ويحتوي على كل خلية حقيقية النواة أيضا الآلاف من النسخ من الحمض النووي دائرية صغيرة في المصفوفة الميتوكوندريا. بينما الحمض النووي (و mtDNA) بترميز مفارز الأساسية من سلسلة نقل الإلكترون، يتم ترميز غالبية بروتيوم الميتوكوندريا، بما في ذلك جميع العوامل لتكرار ونسخ الحمض النووي الميتوكوندري من الجينوم النووي. وعلى النقيض من الجينوم النووي الذي يتبع قوانين مندل للالميراث، ورثت جينوم الميتوكوندريا الحيوان حصريا من خلال النسب الأمومي. ولذلك، فهم كيف انتشرت و mtDNA والتي تنتقل من جيل إلى جيل من خلال البويضة الأنثوية من المهم بشكل أساسي. ومع ذلك، هناك استمرار الجدل حول كيفية تنظيم النسخ و mtDNA في سلالة الجرثومية الإناث. بالإضافة إلى ذلك، فإن نظرية عنق الزجاجة و mtDNA مقبولة على نطاق واسع لنقل و mtDNA تشير إلى أن عدد سكان و mtDNA في الخلايا الجرثومية البدائية وsubsampled على عدد صغير نسبيا الزيتوتطوير ز 1 2. فإنه يعني أيضا أن مستوى الميتوكوندريا النسخ المتماثل زمانيا ومكانيا منظم خلال مراحل تكوين البويضات. وبالتالي، فإن في الموقع كشف النسخ المتماثل و mtDNA خلال تطوير سلالة الجرثومية تسهيل فهم آلية الميراث و mtDNA.
يوفر ذبابة الفاكهة مراحل تكوين البويضات نظام لين العريكة وراثيا لدراسة النسخ و mtDNA وانتقال العدوى. في كل من البلدين المبايض ذبابة الفاكهة، وهناك 16-20 سلاسل مستقلة من غرف البيض دعا ovarioles 3، والتي هي وحدات وظيفية لإنتاج البيض (انظر الشكل 1A). يحتوي كل ovariole منظمة الخطي التدريجي للمراحل تكوين البويضات، حيث يتكون الطرف الأمامي من بنية تسمى germarium. وينقسم germarium إلى أربع مناطق التي تحتوي على الخلايا الجرثومية في مراحل تنموية مختلفة. في منطقة 1، والخلايا الجذعية سلالة الجرثومية تذهب من خلال تقسيم غير المتماثلة لإنتاج الخلايا الوليدة المعروفة باسم جystoblasts. المنطقة 2A يحتوي على cystoblasts التي استكملت تقسيم النهائي. Cystoblasts الخضوع لأربع جولات من إنتاج الفرقة مجموعة 16 خلية. تبقى الخلايا 16 متصلة مع بعضها البعض عن طريق جسور حشوية تسمى القنوات الحلبة. واحدة من الخلايا فقط تلتزم التمايز كما البويضة، في حين وضع 15 آخرين على شكل خلايا الممرضة المتعددة الصبغيات. هيكل حشوية أساسي، والمعروفة باسم fusome، ويقترح لتسهيل مهمة تشكيل قنوات حلقة، وتحديد قطبية الكيس والممرضة التفاعلات خلية بويضة 4،5. كما تتحرك الخراجات نحو المنطقة 2B، الهياكل كيس تمتد على كامل عرض germarium، وتصبح أكثر المرتبطة خلايا بصيلات. الهياكل germarium تنتهي مع المنطقة 3 التي تحتوي على أول مهدها غرفة البيض. وفي وقت لاحق، يتم تجميع الدوائر البيض في نهاية الخلفية لgermarium، التي تقدم من خلال ovariole في 14 مراحل متميزة شكليا. نمو البويضة يعتمد على خلايا ممرضة، ذوي الخوذات البيضاءبروتينات النقل التراث الثقافي غير المادي، مرنا والهياكل endomembrane (على سبيل المثال، جولجي) عبر القنوات حلقة في البويضة. خلال ذبابة الفاكهة مراحل تكوين البويضات، تبين أن جزءا من الميتوكوندريا داخل كل كيس 16 خلية ارتبطت مع fusome، انتقل من خلال القنوات عصابة وتم تسليمها إلى البويضة واحدة في كتلة كبيرة تسمى بالبياني الجسم 6. واقترح هذه الظاهرة إلى المساهمة في مراقبة الجودة من الميراث الميتوكوندريا من خلال المبايض الأنثوية.
الكشف عن تركيب الحمض النووي الميتوكوندري يعتمد على إدراج السلائف الحمض النووي المسمى في الحمض النووي الخلوي. تقليديا، تم استخدام التناظرية نيكليوزيد من الثيميدين 5-برومو-2'-deoxyuridine (BrdU) لتسمية النسخ و mtDNA في الخلايا زراعة الأنسجة 7،8. ومع ذلك، فإن BrdU وضع العلامات على الأضداد يسلك العديد من القيود، وخاصة بالنسبة للتلوين الأنسجة كله جبل. عيب واحد كبير من BrdU وضع العلامات هو أنه يتطلب تمسخ الحمض النووي للكشف عنحاتمة BrdU، بحيث يمكن الكشف عنها من قبل الأجسام المضادة لمكافحة BrdU. لابد من التعامل مع العينة في ظل ظروف تغيير طبيعة قاسية مثل المواد الكيميائية (مثل حمض الهيدروكلوريك أو خليط من الميثانول وحمض الخليك)، والحرارة، أو الهضم مع الدناز، والتي قد تعطل بنية العينة وتعقيد إجراءات تلطيخ التالية 9، 10.
هنا، يتم استخدام بديلة الثيميدين التناظرية 5 إيثينيل-2'-deoxyuridine (EDU) لتسمية الحمض النووي تكرار في المبايض الكبار ذبابة الفاكهة. هذا الأسلوب هو أسرع وحساسة للغاية. أدرج EDU بسهولة في الحمض النووي الخلوي خلال تكرار الحمض النووي. ويستند الكشف التالية على رد فعل "فوق"، والنحاس (I) -catalyzed رد فعل التساهمية بين مجموعة آلكاين محطة وأزيد الفلورسنت 10. لأن رد الفعل لا يتطلب تمسخ من العينة، لأنها تتيح الحفاظ على هيكلية جيدة. وعلاوة على ذلك، فإن حجم الصبغة لzide هو فقط 1/500 من أن لجزيء الضد 10، والتي تمكن اختراق سريع وفعال من الأنسجة كله جبل. وقد استخدمنا هذه الطريقة للكشف عن النسخ و mtDNA خلال ذبابة الفاكهة مراحل تكوين البويضات وجدت النمط المكاني لافتة في المنطقة germarium من ذبابة الفاكهة المبيض 11، التي تؤدي بنا إلى اقتراح و mtDNA آلية الميراث انتقائية تعتمد على النسخ المتماثل. نقدم هنا بروتوكول مفصل عن EDU الوسم النسخ المتماثل و mtDNA في المبايض ذبابة الفاكهة. للتدليل على تطبيق البروتوكول، ونحن أيضا باختبار النسخ و mtDNA في مستوى الميتوكوندريا متحولة ذبابة الفاكهة (طن متري: هيئة النزاهة T300I) 11، وكذلك مع العلاج متنوعة من uncouplers الميتوكوندريا، مما تبديد غشاء الميتوكوندريا المحتملة، وربما تعطيل النسخ و mtDNA.
Protocol
Representative Results
Discussion
EDU الوسم هو رواية وكفاءة طريقة للكشف عن الحمض النووي في الخلايا المتكاثرة، التي تقوم على دمج وتلطيخ للمتناظرة nucleoside في الحمض النووي توليفها حديثا. هذا الأسلوب هو أفضل من الطريقة BrdU وضع العلامات في أنه من أسرع وحساسة للغاية. الأهم من ذلك، أنها تتيح للحفاظ الهيكلي جيد وفعال اختراق EDU-صبغ كامل جبل الأنسجة 9 و 10. ومن الناحية التاريخية، باعتباره بديلا ممتازا لوضع العلامات BrdU، وكان يستخدم ايدو وضع العلامات لدراسة تكرار الحمض النووي النووي خلال S-مرحلة من مراحل دورة الخلية. Aphidicolin هو المانع من α البلمرة DNA، وهو البلمرة الرئيسي لتكرار الحمض النووي النووي في S-المرحلة 12 15. ويتم تكرار الحمض النووي الميتوكوندري بها γ البلمرة DNA، وهو غير حساس لaphidicolin العلاج. وبالتالي، والمعاملة مع aphidicolin قبل وأثناء حضانة EDU مستعمل بشكل كبير EDU إدماجها في الحامض النووي. أنه ينبغيتجدر الإشارة إلى أن aphidicolin قد تكون مستقرة لعدة أسابيع إذا تخزينها بشكل مناسب، وكان فعالية aphidicolin في تثبيط تكرار الحمض النووي النووي متغير في أيدينا. يجب استبعاد ovarioles أو غرف البيض مع قوي وسم الحامض النووي من تحليلات المزيد من البيانات.
النسخ و mtDNA يمكن تصور بسهولة كما نقاط وفي السيتوبلازم، الذي يتيح أيضا وسيلة واضحة لتحديد مستوى النسخ المتماثل و mtDNA عن طريق حساب عدد من ايدو نقاط و، تطبيع إلى إجمالي حجم السيتوبلازم. برامج التصوير يمكن تطبيقها لتحديد EDU نقاط وتلقائيا في الصور المجهرية، والتي هي مفيدة بشكل خاص للتحاليل الحسابية مجموعات كبيرة من البيانات. ومع ذلك، ينبغي أن تؤخذ الاحتياطات، لأن تثبيط غير مكتملة من تكرار الحمض النووي النووي يمكن أن يؤدي إلى إدماج ايدو في مواضع واضح على كروموسوم وعرض كما نقاط وداخل النواة. أيضا في حالات أخرى، لشدة EDU إدماجها repliقد يكون cating و mtDNA ضعيفة، في حين أن خلفية والضوضاء يمكن أن تكون مرتفعة. ولذلك، فإن المعلمات الفردية لتحليل التلقائي للصورة يجب أن تحدد بعناية. ويوصى أيضا أن الصور يجب فحص بعيون مدربة للتأكد من أن يتم تحديد المناسبة EDU نقاط و.
التصور و mtDNA تصنيعه حديثا خلال ذبابة الفاكهة مراحل تكوين البويضات يوفر فرصة لمعرفة كيف يتم تنظيم النسخ و mtDNA في ظل ظروف فيزيولوجية أو مرضية، من خلال تنفيذ التجربة في الذباب يتعرض لمجموعة متنوعة من الاضطرابات الدوائية أو وراثية. في دراسة سابقة، أجريت EDU التأسيس فحص في مستوى الميتوكوندريا متحولة ذبابة الفاكهة طن متري: هيئة النزاهة T300I 11. وعلاوة على ذلك، لتعطيل إمكانات غشاء الميتوكوندريا، تم علاج المبيض مع تركيزات مختلفة من FCCP uncoupler الميتوكوندريا أو 2،4-نيتروفينول (إدارة التخطيط الوطني) قبل ايدو التأسيس. تبعا لأغراض تجريبيةوخصائص الدواء، يمكن اعتماد أساليب مختلفة للتسليم الفعلي. لالذباب الكبار، ويمكن عرض المخدرات في شكل بخار (على سبيل المثال، والإيثانول والكوكايين) 16،17 أو يمكن حقن المخدرات في البطن، حيث ينتشر بسرعة في جميع أنحاء الجسم 18. الممارسة الأكثر شيوعا هو أن الأدوية التي تضاف إلى الطعام ذبابة أو / ورقة مرشح مشبعة المخدرات السكروز. على سبيل المثال، والمانع من الجمعية أنيبيب، الكولشيسين، لتغذية الذباب لمدة 2-3 أيام قبل تشريح المبيض 19. وبالتالي، فمن المهم تقييم طريقة إيصال الدواء واختيار تركيزات مناسبة.
لضمان التصوير الناجح لتكرار الحمض النووي الميتوكوندري في المبايض ذبابة الفاكهة، يجب أن يتم تنفيذ بعناية العديد من الخطوات الهامة. قبل كل شيء، والحفاظ على سلامة وصحة المبيضين أثناء تشريح وايدو التأسيس ضروري (الخطوات 1 و 2). متوسطة ذبابة الفاكهة وشنايدر مع FBS يحتاج إلى أن تكون درجة حرارة لRTقبل الاستعمال. ينبغي للمرء أن تقليل الاتصال المباشر بين الدوائر البيض وأدوات تشريح أو نصائح ماصة. يجب أن تكون مغمورة المبايض تحت حلول جميع الأوقات لتجنب الجفاف. سوء الأنسجة يمكن أن يؤدي بسهولة إلى الاغماء أو أي إشارات الفلورسنت. خلال الخطوة الأنسجة المتصاعدة، يجب فصل ovarioles من بعضها البعض، وانتشرت على شريحة المجهر. تأكد من عدم مكدسة الدوائر البيض على رأس كل منهما الآخر. لاحظنا أن الدوائر البيض وراء مرحلة 14 عرض القليل من ايدو التأسيس. بالإضافة إلى ذلك، لأن من الحجم الكبير، وغالبا ما تسبب غرف بيضة المرحلة المتأخرة المجاورة غرف البيض الشابة لتكون بعيدة عن التركيز. وبالتالي فمن المستحسن أن يتم تجاهل غرف مرحلة متأخرة البيض.
نحن هنا نقدم بروتوكول مفصل لوضع العلامات تكرار الحمض النووي الميتوكوندري في المبايض الكبار ذبابة الفاكهة. وتسمح هذه الطريقة لتقدير بسيط من النسخ و mtDNA تحت مختلف الاضطرابات الوراثية والدوائية،وسوف تكون مفيدة لتشريح الآليات الكامنة وراء نشوء حيوي الميتوكوندريا التنموي والميراث و mtDNA.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank K. Delaney for comments on the manuscript. This work was supported by the National, Heart, Lung, and Blood Institute (NHLBI) Intramural Program.
Materials
| Schneider’s Drosophila medium | Invitrogen | 21720-024 | |
| FBS | Invitrogen | 10100-147 | |
| Pair of Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Aphidicolin | Sigma | A0781 | Aliquot after dissolving in DMSO. Avoid repetitive thawing and freezing. Protect from light. May be used within 6 weeks after dissolving. |
| FCCP | Sigma | C2920 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Paraformaldehyde, 16% EM grade | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Formaldehyde is toxic; it should be handled in a fume hood with skin and eye protection. |
| PBS | KD Medical | RGF-3190 | |
| BSA | Sigma | A7030 | |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
| Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging Kit | Invitrogen | C10337 | EdU, CuSO4, Alexa Fluor 488 azide, EdU reaction buffer and Edu buffer additive are included |
| Mouse ATP synthase subunit α antibody, (15H4C4) | MitoSciences | Ab14748 | 1:1000 dilution |
| Mouse Hts antibody (clone RC) | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | hts RC | 1:1000 dilution |
| Goat anti-mouse Alexa Fluor 568 secondary antibody | Invitrogen | A-11004 | 1:200 dilution |
| Vectashield mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1500 | |
| Glass coverslips, #1.5 22 x 22 mm | Fisher Scientific | 12-541-B | |
| Microscope slide | Fisher Scientific | 22-038-103 | |
| Nail polish | Elf | Many of the pigments used in nail polishes are fluorescent and leach into specimens. Only clear nail polish should be used. |
References
- Taylor, R. W., Turnbull, D. M. Mitochondrial DNA mutations in human disease. Nat Rev Genet. 6 (5), 389-402 (2005).
- Wallace, D. C., Chalkia, D. Mitochondrial DNA genetics and the heteroplasmy conundrum in evolution and disease. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (11), a021220 (2013).
- Spradling, A. C. . The development of Drosophila melanogaster. , (1993).
- Riechmann, V., Ephrussi, A. Axis formation during Drosophila oogenesis. Curr Opin Genet Dev. 11 (4), 374-383 (2001).
- Lin, H., Yue, L., Spradling, A. C. The Drosophila fusome, a germline-specific organelle, contains membrane skeletal proteins and functions in cyst formation. Development. 120 (4), 947-956 (1994).
- Cox, R. T., Spradling, A. C. A Balbiani body and the fusome mediate mitochondrial inheritance during Drosophila oogenesis. Development. 130 (8), 1579-1590 (2003).
- Davis, A. F., Clayton, D. A. In situ localization of mitochondrial DNA replication in intact mammalian cells. J Cell Biol. 135 (4), 883-893 (1996).
- Iborra, F. J., Kimura, H., Cook, P. R. The functional organization of mitochondrial genomes in human cells. BMC Biol. 2, (2004).
- Rakic, P. Neurogenesis in adult primate neocortex: an evaluation of the evidence. Nat Rev Neurosci. 3 (1), 65-71 (2002).
- Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (7), 2415-2420 (2008).
- Hill, J. H., Chen, Z., Xu, H. Selective propagation of functional mitochondrial DNA during oogenesis restricts the transmission of a deleterious mitochondrial variant. Nat Genet. 46 (4), 389-392 (2014).
- Lentz, S. I., et al. Mitochondrial DNA (mtDNA) Biogenesis: Visualization and Duel Incorporation of BrdU and EdU Into Newly Synthesized mtDNA In Vitro. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 58 (2), 207-218 (2010).
- Tornoe, C. W., Christensen, C., Meldal, M. Peptidotriazoles on solid phase: [1,2,3]-triazoles by regiospecific copper(i)-catalyzed 1,3-dipolar cycloadditions of terminal alkynes to azides. J Org Chem. 67 (9), 3057-3064 (2002).
- Horwitz, H. B., Holt, C. E. Specific inhibition by ethidium bromide of mitochondrial DNA synthesis in physarum polycephalum. J. Cell Biol. 49, 546-553 (1971).
- Huberman, J. A. New views of the biochemistry of eucaryotic DNA replication revealed by aphidicolin, an unusual inhibitor of DNA polymerase alpha. Cell. 23 (3), 647-648 (1981).
- McClung, C., Hirsh, J. Stereotypic behavioral responses to free-base cocaine and the development of behavioral sensitization in Drosophila. Curr Biol. 8 (2), 109-112 (1998).
- Moore, M. S., et al. Ethanol intoxication in Drosophila: Genetic and pharmacological evidence for regulation by the cAMP signaling pathway. Cell. 93 (6), 997-1007 (1998).
- Dzitoyeva, S., Dimitrijevic, N., Manev, H. Gamma-aminobutyric acid B receptor 1 mediates behavior-impairing actions of alcohol in Drosophila: adult RNA interference and pharmacological evidence. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (9), 5485-5490 (2003).
- Koch, E. A., Spitzer, R. H. Multiple effects of colchicine on oogenesis in Drosophila: induced sterility and switch of potential oocyte to nurse-cell developmental pathway. Cell Tissue Res. 228 (1), 21-32 (1983).
