В Ситу маркировки репликации митохондриальной ДНК в Drosophila взрослых яичников с помощью EDU Окрашивание
Summary
Drosophila oogenesis continues to be exceptionally useful in the study of mitochondrial proliferation and inheritance. This manuscript describes a detailed protocol used to label the replicating mitochondrial DNA (mtDNA) in Drosophila adult ovaries with 5-ethynyl-2´-deoxyuridine (EdU), which facilitates uncovering mechanisms associated with mitochondrial inheritance that were previously debatable.
Abstract
The mitochondrial genome is inherited exclusively through the maternal line. Understanding of how the mitochondrion and its genome are proliferated and transmitted from one generation to the next through the female oocyte is of fundamental importance. Because of the genetic tractability, and the elegant, ordered simplicity by which oocyte development proceeds, Drosophila oogenesis has become an invaluable system for mitochondrial study. An EdU (5-ethynyl-2´-deoxyuridine) labeling method was utilized to detect mitochondrial DNA (mtDNA) replication in Drosophila ovaries. This method is superior to the BrdU (5-bromo-2′-deoxyuridine) labeling method in that it allows for good structural preservation and efficient fluorescent dye penetration of whole-mount tissues.
Here we describe a detailed protocol for labeling replicating mitochondrial DNA in Drosophila adult ovaries with EdU. Some technical solutions are offered to improve the viability of the ovaries, maintain their health during preparation, and ensure high-quality imaging. Visualization of newly synthesized mtDNA in the ovaries not only reveals the striking temporal and spatial pattern of mtDNA replication through oogenesis, but also allows for simple quantification of mtDNA replication under various genetic and pharmacological perturbations.
Introduction
К тому же ядерный геном, каждый эукариотические клетки также содержит тысячи копий круговым ДНК в митохондриях. В то время как митохондриальной ДНК (мтДНК) кодирует существенные субъединиц цепи переноса электронов, большинство митохондриальной протеомом, включая все факторы для репликации и транскрипции мтДНК кодируются ядерным геномом. В отличие от ядерного генома, который следует Менделевские законы наследования, животное митохондриальный геном наследуется исключительно по материнской линии. Таким образом, понимание того, как мтДНК и распространение передается от одного поколения к другому по женской яйцеклетки является принципиально важным. Тем не менее, есть продолжаются дебаты о том, как репликация мтДНК регулируется в женском зародышевой. Кроме того, широкое признание мтДНК теория узким местом для передачи мтДНК свидетельствует о том, что население мтДНК в примордиальных зародышевых клеток к половинной дискретизации относительно небольшого числа Дуринг развитие 1 2. Это также означает, что репликация мтДНК во времени и пространстве регулируется во время оогенеза. Таким образом, на месте обнаружения репликации мтДНК во время зародышевого развития будет способствовать пониманию механизма наследования мтДНК.
Drosophila оогенез обеспечивает генетически послушный систему для изучения репликации мтДНК и передачи. В каждом из двух яичников у Drosophila, есть 16-20 независимые струны яйцевых камер называемые овариол 3, которые являются функциональными единицами производства яиц (см рисунок 1А). Каждая яйцевая трубка содержит прогрессивную линейную организацию оогенезе, где передний конец состоит из структуры под названием гермарии. Гермарии делится на четыре области, которые содержат зародышевые клетки на различных стадиях развития. В области 1, зародышевые стволовые клетки проходят через асимметричного деления для получения клеток, известных как дочерние Cystoblasts. Область 2a содержит cystoblasts, которые завершили свое окончательное разделение. Cystoblasts пройти четыре раунда группы разделения производства 16-клеток. Эти 16 клетки остаются соединенными друг с другом с помощью цитоплазматических мостиков называемые кольцевые каналы. Только одна из ячеек берет на себя обязательство дифференциации в качестве ооцитов, в то время как другие 15 развиваются как полиплоидных трофоцитов. Существенной цитоплазматический структура, известная как fusome, предлагается , чтобы облегчить с образованием кольцевых каналов, определить полярность и кист медсестре клеток-ооцит взаимодействий 4,5. По мере того как цисты двигаться в направлении области 2b, киста структуры охватывают всю ширину гермарии, и стать в большей степени связаны с фолликула клетками. В гермарии структуры заканчиваются областью 3, содержащий первый многообещающий яйцевой камеры. Впоследствии яичные камеры собираются на заднем конце гермарии, который прогрессировать через яйцевая трубка в 14 морфологически различных этапах. Рост ооцита зависит от питающих клеток, ВГICH транспортных белков, мРНК и эндомембранную структуры (например, Гольджи) через кольцевые каналы в яйцеклетку. Во время Drosophila оогенезе, было обнаружено , что доля митохондрий в пределах каждого 16-клеток цисты были связаны с fusome, перемещаемых через кольцевые каналы , и были доставлены в единый ооцита в большой массе под названием Balbiani тело 6. Было предложено Это явление, чтобы внести свой вклад в контроль качества митохондриального наследования через женских яичников.
Обнаружение синтеза мтДНК опирается на включение меченых предшественников ДНК в клеточную ДНК. Традиционно, аналог нуклеозида тимидина 5-бром-2'-дезоксиуридина (BrdU) был использован для обозначения репликации мтДНК в клетках для культивирования тканей 7,8. Тем не менее, на основе антител маркировки BrdU демонстрирует несколько ограничений, особенно для окрашивания тканей целом монтажа. Одним из основных недостатков маркировки BrdU является то, что она требует денатурации ДНК подвергатьBrdU эпитоп, так что он может быть обнаружен с помощью анти-BrdU антителами. Образец должен быть обработан в жестких денатурирующих условиях , таких как химические вещества (например, хлористо – водородная кислота или смеси метанола и уксусной кислоты), тепло, или переваривание ДНКазой, которые могут нарушить структуру образца и усложняют следующей процедуры окрашивания 9, 10.
Здесь, альтернативный аналоговый тимидин 5-этинил-2'-деоксиуридин (EDU) используется для обозначения тиражирование митохондриальной ДНК у дрозофилы взрослых яичников. Этот метод быстрее и очень чувствительным. Edu легко включены в клеточную ДНК во время репликации ДНК. Следующее определение основано на "щелчок" реакции получают Cu (I) -catalyzed ковалентные реакции между концевым алкинов группой и люминесцентным азида 10. Поскольку реакция не требует денатурации образца, он обеспечивает хорошую структурную сохранность. Кроме того, размер красителеЗайд только 1/500 , что молекулы антитела 10, что позволяет быстро и эффективно проникновение тканей целом монтажа. Мы использовали этот метод для обнаружения репликации мтДНК в течение Drosophila оогенеза и обнаружили поразительную пространственную структуру в гермарии области Drosophila яичнике 11, которые приводят нас предложить репликации зависящих от мтДНК механизма селективного наследования. Мы представляем здесь подробный протокол о маркировке Edu репликации мтДНК в Drosophila яичников. Для того, чтобы продемонстрировать применение протокола, мы также тестировали репликацию мтДНК в мтДНК мутанта дрозофилы (мт: ИСП T300I) 11, а также с разнообразными лечения митохондриальных разобщителей, которые рассеивают митохондриальный мембранный потенциал и потенциально нарушают репликацию мтДНК.
Protocol
Representative Results
Discussion
ОБР маркировка представляет собой новый и эффективный метод для обнаружения ДНК-синтез в пролиферирующих клетках, которая основана на включении и окрашивания аналогов нуклеозидов во вновь синтезированную ДНК. Этот метод превосходит метода BrdU маркировки в том, что она быстрее и очень чувствительным. Что еще более важно, это позволяет хорошей структурной сохранности и эффективного проникновения Edu-красителя в целом монтажа тканей 9, 10. Исторически сложилось так , как лучшей альтернативой для маркировки BrdU, маркировка EDU была использована для изучения репликации ядерной ДНК во время S-фазы в клеточный цикл. Aphidicolin является ингибитором ДНК – полимеразы альфа, которая является основным полимеразной для репликации ядерной ДНК в S-фазе 12 15. репликации мтДНК осуществляется ДНК-полимеразы у, которая нечувствительна к aphidicolin лечению. Следовательно, лечение с aphidicolin до и во время инкубации Edu значительно ингибирует Edu включение в ядерной ДНК. ДолжноСледует отметить, что aphidicolin могут быть стабильными в течение нескольких недель, если соответствующим образом сохранены, а эффективность aphidicolin в ингибирования репликации ядерной ДНК была различной в наших руках. В овариол или яичные камеры с сильной маркировки ядерной ДНК должны быть исключены из анализа дополнительных данных.
репликации мтДНК можно легко представить себе как Puncta в цитоплазме, которая также предоставляет простой способ количественной оценки уровня репликации мтДНК путем подсчета числа EDU Puncta, нормализованное к общему объему цитоплазмы. Программное обеспечение визуализации может быть применен для автоматической идентификации Edu Puncta в микроскопических изображений, что особенно полезно для вычислительных анализа больших массивов данных. Тем не менее, следует принимать меры предосторожности, так как неполное подавление репликации ядерной ДНК может привести к включению ОБР в разных локусах на хромосоме и отображения, как Puncta внутри ядра. Кроме того, в других случаях, интенсивность ОБР включению в Repliдой мтДНК может быть слабым, в то время как фон и шум может быть высоким. Поэтому следует тщательно определить отдельные параметры для автоматического анализа изображений. Кроме того, рекомендуется, что изображения должны быть исследованы с дрессированными глаза, чтобы убедиться, что надлежащее Edu Puncta идентифицированы.
Визуализация вновь синтезированной мтДНК во время Drosophila оогенезе дает возможность исследовать , как репликация мтДНК регулируется в физиологических или патологических состояний, путем проведения эксперимента у мух , подвергнутых различным фармакологическим или генетических возмущений. В предыдущем исследовании, Edu включение анализа проводили в мтДНК мутанта дрозофилы мт ИСП T300I 11. Кроме того, чтобы нарушить митохондриального мембранного потенциала, яичники обрабатывали различными концентрациями митохондриальной разобщитель FCCP или 2,4-динитрофенол (ДНФ) до ОБР включения. В зависимости от экспериментальных целейи характеристики наркотиков, различные методы могут быть приняты для эффективной доставки. Для взрослых мух, препараты могут быть представлены в виде паров (например, этанол и кокаин) 16,17 или лекарственные средства могут быть введены в брюшную полость, где он быстро распространяется по всему телу 18. Наиболее распространенной практикой является то, что наркотики добавляются в пищу мух или / фильтровальную бумагу лекарственной насыщенный сахарозы. Например, ингибитор сборку микротрубочек, колхицин, подавался на мух в течение 2-3 дней , прежде чем яичник рассечение 19. Следовательно, важно, чтобы оценить метод доставки лекарственных средств, и выбрать соответствующие концентрации.
Для того, чтобы обеспечить успешную съемку репликации мтДНК в Drosophila яичников, несколько важных шагов должны быть тщательно выполнены. В первую очередь, сохранение жизнеспособности и здоровья яичников во время вскрытия и Эду включения существенно (шаги 1 и 2). Drosophila среде Шнайдера с FBS необходимо прогреть до комнатной температурыперед использованием. Нужно свести к минимуму непосредственный контакт между яичных камерами и Препарационные инструментов или пипеток. Яичники должны быть погружены под решения все время, чтобы избежать обезвоживания. Неправильное обращение ткани легко может привести не упасть в обморок или нет флуоресцентные сигналы. На стадии монтажа ткани, овариол должны быть отделены друг от друга и разложенные на предметное стекло микроскопа. Убедитесь, что яичные камеры не укладываются друг на друга. Мы заметили, что яичные камеры вне стадии 14 отображается немного Edu включения. Кроме того, из-за большого размера, на поздней стадии яичные камеры часто вызывают соседние молодые яичные камеры, чтобы быть в фокусе. Таким образом, рекомендуется, чтобы поздней стадии яичные камеры будут отброшены.
Здесь мы предлагаем подробный протокол для маркировки тиражирование мтДНК в дрозофилы взрослых яичников. Этот метод позволяет простой количественной оценки репликации мтДНК в различных генетических и фармакологических возмущений,и будет полезен для рассечения механизмов, лежащих в основе с развитием митохондриальной биогенеза и наследование мтДНК.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank K. Delaney for comments on the manuscript. This work was supported by the National, Heart, Lung, and Blood Institute (NHLBI) Intramural Program.
Materials
| Schneider’s Drosophila medium | Invitrogen | 21720-024 | |
| FBS | Invitrogen | 10100-147 | |
| Pair of Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Aphidicolin | Sigma | A0781 | Aliquot after dissolving in DMSO. Avoid repetitive thawing and freezing. Protect from light. May be used within 6 weeks after dissolving. |
| FCCP | Sigma | C2920 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Paraformaldehyde, 16% EM grade | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Formaldehyde is toxic; it should be handled in a fume hood with skin and eye protection. |
| PBS | KD Medical | RGF-3190 | |
| BSA | Sigma | A7030 | |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
| Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging Kit | Invitrogen | C10337 | EdU, CuSO4, Alexa Fluor 488 azide, EdU reaction buffer and Edu buffer additive are included |
| Mouse ATP synthase subunit α antibody, (15H4C4) | MitoSciences | Ab14748 | 1:1000 dilution |
| Mouse Hts antibody (clone RC) | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | hts RC | 1:1000 dilution |
| Goat anti-mouse Alexa Fluor 568 secondary antibody | Invitrogen | A-11004 | 1:200 dilution |
| Vectashield mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1500 | |
| Glass coverslips, #1.5 22 x 22 mm | Fisher Scientific | 12-541-B | |
| Microscope slide | Fisher Scientific | 22-038-103 | |
| Nail polish | Elf | Many of the pigments used in nail polishes are fluorescent and leach into specimens. Only clear nail polish should be used. |
References
- Taylor, R. W., Turnbull, D. M. Mitochondrial DNA mutations in human disease. Nat Rev Genet. 6 (5), 389-402 (2005).
- Wallace, D. C., Chalkia, D. Mitochondrial DNA genetics and the heteroplasmy conundrum in evolution and disease. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (11), a021220 (2013).
- Spradling, A. C. . The development of Drosophila melanogaster. , (1993).
- Riechmann, V., Ephrussi, A. Axis formation during Drosophila oogenesis. Curr Opin Genet Dev. 11 (4), 374-383 (2001).
- Lin, H., Yue, L., Spradling, A. C. The Drosophila fusome, a germline-specific organelle, contains membrane skeletal proteins and functions in cyst formation. Development. 120 (4), 947-956 (1994).
- Cox, R. T., Spradling, A. C. A Balbiani body and the fusome mediate mitochondrial inheritance during Drosophila oogenesis. Development. 130 (8), 1579-1590 (2003).
- Davis, A. F., Clayton, D. A. In situ localization of mitochondrial DNA replication in intact mammalian cells. J Cell Biol. 135 (4), 883-893 (1996).
- Iborra, F. J., Kimura, H., Cook, P. R. The functional organization of mitochondrial genomes in human cells. BMC Biol. 2, (2004).
- Rakic, P. Neurogenesis in adult primate neocortex: an evaluation of the evidence. Nat Rev Neurosci. 3 (1), 65-71 (2002).
- Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (7), 2415-2420 (2008).
- Hill, J. H., Chen, Z., Xu, H. Selective propagation of functional mitochondrial DNA during oogenesis restricts the transmission of a deleterious mitochondrial variant. Nat Genet. 46 (4), 389-392 (2014).
- Lentz, S. I., et al. Mitochondrial DNA (mtDNA) Biogenesis: Visualization and Duel Incorporation of BrdU and EdU Into Newly Synthesized mtDNA In Vitro. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 58 (2), 207-218 (2010).
- Tornoe, C. W., Christensen, C., Meldal, M. Peptidotriazoles on solid phase: [1,2,3]-triazoles by regiospecific copper(i)-catalyzed 1,3-dipolar cycloadditions of terminal alkynes to azides. J Org Chem. 67 (9), 3057-3064 (2002).
- Horwitz, H. B., Holt, C. E. Specific inhibition by ethidium bromide of mitochondrial DNA synthesis in physarum polycephalum. J. Cell Biol. 49, 546-553 (1971).
- Huberman, J. A. New views of the biochemistry of eucaryotic DNA replication revealed by aphidicolin, an unusual inhibitor of DNA polymerase alpha. Cell. 23 (3), 647-648 (1981).
- McClung, C., Hirsh, J. Stereotypic behavioral responses to free-base cocaine and the development of behavioral sensitization in Drosophila. Curr Biol. 8 (2), 109-112 (1998).
- Moore, M. S., et al. Ethanol intoxication in Drosophila: Genetic and pharmacological evidence for regulation by the cAMP signaling pathway. Cell. 93 (6), 997-1007 (1998).
- Dzitoyeva, S., Dimitrijevic, N., Manev, H. Gamma-aminobutyric acid B receptor 1 mediates behavior-impairing actions of alcohol in Drosophila: adult RNA interference and pharmacological evidence. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (9), 5485-5490 (2003).
- Koch, E. A., Spitzer, R. H. Multiple effects of colchicine on oogenesis in Drosophila: induced sterility and switch of potential oocyte to nurse-cell developmental pathway. Cell Tissue Res. 228 (1), 21-32 (1983).
