In Situ Labeling van mitochondriaal DNA-replicatie in Drosophila volwassen Eierstokken van Edu kleuring
Summary
Drosophila oogenesis continues to be exceptionally useful in the study of mitochondrial proliferation and inheritance. This manuscript describes a detailed protocol used to label the replicating mitochondrial DNA (mtDNA) in Drosophila adult ovaries with 5-ethynyl-2´-deoxyuridine (EdU), which facilitates uncovering mechanisms associated with mitochondrial inheritance that were previously debatable.
Abstract
The mitochondrial genome is inherited exclusively through the maternal line. Understanding of how the mitochondrion and its genome are proliferated and transmitted from one generation to the next through the female oocyte is of fundamental importance. Because of the genetic tractability, and the elegant, ordered simplicity by which oocyte development proceeds, Drosophila oogenesis has become an invaluable system for mitochondrial study. An EdU (5-ethynyl-2´-deoxyuridine) labeling method was utilized to detect mitochondrial DNA (mtDNA) replication in Drosophila ovaries. This method is superior to the BrdU (5-bromo-2′-deoxyuridine) labeling method in that it allows for good structural preservation and efficient fluorescent dye penetration of whole-mount tissues.
Here we describe a detailed protocol for labeling replicating mitochondrial DNA in Drosophila adult ovaries with EdU. Some technical solutions are offered to improve the viability of the ovaries, maintain their health during preparation, and ensure high-quality imaging. Visualization of newly synthesized mtDNA in the ovaries not only reveals the striking temporal and spatial pattern of mtDNA replication through oogenesis, but also allows for simple quantification of mtDNA replication under various genetic and pharmacological perturbations.
Introduction
Naast het nucleaire genoom, elke eukaryote cel bevat ook duizenden exemplaren van kleine cirkelvormige DNA in de mitochondriale matrix. Terwijl mitochondriaal DNA (mtDNA) codeert essentiële subeenheden van electronentransportketting de meerderheid van de mitochondriale proteoom, waaronder alle elementen voor replicatie en transcriptie van mtDNA gecodeerd door het nucleaire genoom. In tegenstelling tot het nucleaire genoom die Mendeliaanse erfrechterlijk volgt, wordt het dier mitochondriaal genoom exclusief geërfd via de moederlijn. Daarom begrijpen hoe mtDNA wordt verspreid en overgedragen van de ene generatie naar de volgende door middel van de vrouwelijke eicel is van fundamenteel belang. Echter, er is voortdurende discussie over de vraag hoe mtDNA replicatie is geregeld in de vrouwelijke kiemlijn. Daarnaast is de algemeen aanvaarde mtDNA knelpuntentheorie voor mtDNA transmissie suggereert dat de populatie van mtDNA in primordiale kiemcellen is subsampled een relatief klein aantal during ontwikkeling 1 2. Het houdt ook in dat mtDNA replicatie is tijd en ruimte gereguleerd tijdens oögenese. Daarom zal de in situ detectie van mtDNA replicatie tijdens kiemlijn ontwikkeling van het inzicht in het mechanisme van mtDNA overerving vergemakkelijken.
Drosophila oögenese biedt een genetisch handelbaar systeem om mtDNA replicatie en transmissie te bestuderen. In elk van de twee Drosophila eierstokken, er 16-20 onafhankelijke strengen ei kamers genoemd ovarioles 3, waarbij de functionele eenheden van eierproductie zijn (zie figuur 1A). Elke ovariole bevat een geleidelijke lineaire ordening oögenese, waarbij het voorste uiteinde bestaat uit een structuur genaamd germarium. De germarium is verder onderverdeeld in vier regio's die kiemcellen in verschillende ontwikkelingsstadia bevatten. In regio 1, kiembaan stamcellen gaan door asymmetrische divisie dochtercellen bekend als c producerenystoblasts. Regio 2a bevat de cystoblasts dat hun laatste divisie hebben afgerond. Cystoblasts ondergaan vier rondes van verdeeldheid produceren 16-celgroepen. De 16 cellen blijven met elkaar verbonden door cytoplasmatische bruggetjes grachten. Slechts één van de cellen verbindt differentiatie als de eicel, terwijl de andere 15 ontwikkelen polyploïde cellen verpleegster. Essentieel cytoplasmatische structuur, bekend als fusome wordt voorgesteld vergemakkelijken de vorming van grachten, bepalen de cyste polariteit en de verpleegkundige cel-interacties eicel 4,5. Aangezien de cysten komen tot gebied 2b, de cyste structuren overspannen de gehele breedte van de germarium, en meer geassocieerd met follikelcellen. De germarium structuren eindigen met regio 3 met daarin de eerste ontluikende ei kamer. Vervolgens worden de ei kamers gemonteerd aan het achterste uiteinde van de germarium, die verder door de ovariole in 14 morfologisch verschillende fasen. De groei van de eicel is afhankelijk van de verpleegster cellen, which transporteiwitten, mRNA en endomembrane structuren (bijv Golgi) via de grachten in de eicel. Tijdens Drosophila oogenesis, werd gevonden dat een fractie van de mitochondriën in elke cel 16 cysten werden bij dit fusome, bewogen door de grachten en afgeleverd in de interne eicel in een grote massa genaamd Balbiani lichaam 6. Dit fenomeen werd voorgesteld bij te dragen tot de kwaliteitscontrole van mitochondriale erfelijkheid vrouwelijke eierstokken.
Detectie van mtDNA synthese is gebaseerd op de opname van gelabelde DNA precursors in cellulair DNA. Traditioneel, een nucleoside-analoog van thymidine 5-broom-2'-deoxyuridine (BrdU) werd gebruikt om het mtDNA replicatie in weefselcultuur cellen 7,8 labelen. Echter, de antilichaam-gebaseerde BrdU labeling vertoont een aantal beperkingen, in het bijzonder voor de hele-mount weefsel kleuring. Een groot nadeel van BrdU labeling is dat het DNA denaturatie blootde BrdU epitoop, zodat het kan worden gedetecteerd door het anti-BrdU-antilichaam. Het monster moet worden behandeld onder zware denaturerende omstandigheden zoals chemicaliën (bijvoorbeeld, zoutzuur of mengsels van methanol en azijnzuur), warmte of digestie met DNase, die de structuur van het monster kunnen verstoren en bemoeilijken de volgende kleuringsprocedure 9, 10.
Hier wordt een alternatieve thymidine analoog 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EDU) gebruikt om het repliceren mitochondriaal DNA in Drosophila volwassen eierstokken labelen. Deze werkwijze is sneller en zeer gevoelig. Edu wordt gemakkelijk in cellulair DNA tijdens de replicatie van DNA opgenomen. De volgende detectie is gebaseerd op een "klik" reactie, een Cu (I) -gekatalyseerde covalente reactie tussen de eindstandige alkyngroep en een fluorescerende azide 10. Omdat de reactie van de denaturatie van het monster vereist, is het mogelijk goede structurele conservering. Bovendien is de grootte van een kleurstofzide is slechts 1/500 van die van een antilichaam-molecuul 10, die een snelle en efficiënte penetratie van whole-mount weefsels mogelijk maakt. We hebben deze methode om mtDNA replicatie detecteren tijdens Drosophila oögenese gebruikt en vond een opvallend ruimtelijk patroon in de germarium regio Drosophila eierstok 11, die ons leiden tot een replicatie-afhankelijke mtDNA selectieve overervingsmechanisme stellen. Wij presenteren hier een gedetailleerd protocol over Edu etikettering van mtDNA replicatie in Drosophila eierstokken. Om de toepassing van het protocol aan te tonen, hebben we ook getest het mtDNA replicatie in een mtDNA mutant Drosophila (mt: CoI T300I) 11, evenals met uiteenlopende behandeling van mitochondriale ontkoppelrails, die het mitochondriale membraanpotentiaal te verdrijven en mogelijk verstoren mtDNA replicatie.
Protocol
Representative Results
Discussion
EDU etikettering een nieuwe en efficiënte methode om DNA-synthese te detecteren in prolifererende cellen, die gebaseerd is op de opname en kleuring van nucleoside analogen nieuw gesynthetiseerde DNA. Deze methode is superieur aan de werkwijze BrdU labeling, dat het sneller en zeer gevoelig. Nog belangrijker, het zorgt voor een goede structurele conservering en efficiënte EDU-kleurstofpenetratie volle-mount weefsels 9, 10. Historisch gezien als een superieur alternatief voor BrdU labeling, edu labeling werd gebruikt voor het bestuderen van nucleaire DNA replicatie gedurende de S-fase van de celcyclus. Afidicoline is een remmer van DNA- polymerase α, die de belangrijkste polymerase nucleaire DNA replicatie S-fase 12 15. mtDNA replicatie door DNA polymerase γ, dat ongevoelig voor behandeling afidicoline uitgevoerd. Derhalve behandeling met afidicoline vóór en tijdens de EDU incubatie remde edu opname in nucleair DNA. Het zou moetengewezen dat afidicoline stabiel gedurende enkele weken kan zijn als geschikte wijze opgeslagen, en de werkzaamheid van afidicoline bij het remmen van nucleair DNA-replicatie was variabel in onze handen. De ovarioles of ei kamers met sterke nucleair DNA-etikettering dienen te worden uitgesloten van verdere data-analyses.
mtDNA replicatie kan gemakkelijk worden gevisualiseerd als puncta in het cytoplasma, welke ook verschaft een eenvoudige manier om het niveau van mtDNA replicatie gekwantificeerd door het tellen van het aantal EDU puncta, genormaliseerd naar het totale volume van cytoplasma. Beeldverwerkingssoftware kunnen worden toegepast om de EDU puncta automatisch identificeren microscopische beelden, wat vooral nuttig is voor computationele analyse van grote datasets. Moet echter voorzorgsmaatregelen worden genomen, omdat de onvolledige inhibitie van nucleair DNA replicatie kan leiden tot de EDE opname in verschillende loci op het chromosoom en worden weergegeven als puncta in de kern. Ook in andere gevallen, de intensiteit van Edu opname in replicating mtDNA zwak is, terwijl de achtergrond en lawaai hoog zijn. Derhalve de afzonderlijke parameters voor automatische beeld analyse zorgvuldig worden gedefinieerd. Ook wordt aanbevolen dat de beelden moeten worden onderzocht met getrainde ogen om ervoor te zorgen dat de juiste edu puncta worden geïdentificeerd.
Visualisatie van nieuw gesynthetiseerde mtDNA in Drosophila oögenese biedt de mogelijkheid om te onderzoeken hoe mtDNA replicatie wordt gereguleerd onder fysiologische of pathologische omstandigheden door het uitvoeren van het experiment met vliegen onderworpen aan een verscheidenheid van farmacologische of genetische verstoringen. In een eerdere studie, werd Edu incorporatie test uitgevoerd in een mtDNA mutant Drosophila mt: CoI T300I 11. Teneinde voorts de mitochondriale membraanpotentiaal verstoren, eierstokken werden behandeld met verschillende concentraties van mitochondriale ontkoppelaar FCCP of 2,4-dinitrofenol (DNP) vóór EDU opname. Afhankelijk van de experimentele doeleindenen drugs kenmerken, verschillende methoden kunnen zijn voor effectieve levering aangenomen. Voor volwassen vliegen, kunnen geneesmiddelen worden gepresenteerd als een damp (bijvoorbeeld ethanol en cocaïne) 16,17 of drugs kan worden geïnjecteerd in de buik, waar het snel diffundeert door het lichaam 18. Het meest gebruikelijk is dat geneesmiddelen worden toegevoegd aan de vlieg voedsel of sucrose / geneesmiddel verzadigd filtreerpapier. Bijvoorbeeld, de remmer van microtubule assemblage, colchicine, werd toegevoerd aan vliegen 2-3 dagen vóór dissectie eierstok 19. Daarom is het belangrijk om de geneesmiddel afgifte-methode evalueren en kies geschikte concentraties.
Om de succesvolle beeldvorming van mtDNA replicatie in Drosophila eierstokken te garanderen, moet een aantal kritische stappen zorgvuldig worden uitgevoerd. Foremost, het behoud van de leefbaarheid en de gezondheid van de eierstokken tijdens de dissectie en Edu integratie van essentieel belang is (stap 1 en 2). Schneider's Drosophila medium met FBS moet worden opgewarmd tot kamertemperatuurvoor gebruik. Men moet direct contact tussen de ei kamers en dissectie gereedschap of pipetpunten te minimaliseren. De eierstokken mag onder oplossingen worden ondergedompeld te allen tijde om uitdroging te voorkomen. Verkeerd gebruik van de weefsels kan gemakkelijk leiden tot flauwvallen of geen tl-signalen. Tijdens het weefsel montagestap moet ovarioles gescheiden van elkaar en verspreid op het microscoopglaasje. Controleer het ei kamers niet gestapeld bovenop elkaar. We hebben gemerkt dat het ei kamers boven het podium 14 weergegeven weinig EDU oprichting. Bovendien, als gevolg van de grote omvang, de late fase ei kamers vaak de oorzaak van het naburige jongere ei kamers zijn onscherp. Zo wordt aanbevolen dat de late stadium ei kamers worden weggegooid.
Hier hebben we een gedetailleerd protocol voor de etikettering repliceren mtDNA in Drosophila volwassen eierstokken. Deze methode zorgt voor een eenvoudige kwantificering van mtDNA replicatie onder verschillende genetische en farmacologische verstoringen,en zal nuttig zijn voor het ontleden van mechanismen die ten grondslag liggen aan de ontwikkeling mitochondriale biogenese en mtDNA erfenis.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank K. Delaney for comments on the manuscript. This work was supported by the National, Heart, Lung, and Blood Institute (NHLBI) Intramural Program.
Materials
| Schneider’s Drosophila medium | Invitrogen | 21720-024 | |
| FBS | Invitrogen | 10100-147 | |
| Pair of Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Aphidicolin | Sigma | A0781 | Aliquot after dissolving in DMSO. Avoid repetitive thawing and freezing. Protect from light. May be used within 6 weeks after dissolving. |
| FCCP | Sigma | C2920 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Paraformaldehyde, 16% EM grade | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Formaldehyde is toxic; it should be handled in a fume hood with skin and eye protection. |
| PBS | KD Medical | RGF-3190 | |
| BSA | Sigma | A7030 | |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
| Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging Kit | Invitrogen | C10337 | EdU, CuSO4, Alexa Fluor 488 azide, EdU reaction buffer and Edu buffer additive are included |
| Mouse ATP synthase subunit α antibody, (15H4C4) | MitoSciences | Ab14748 | 1:1000 dilution |
| Mouse Hts antibody (clone RC) | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | hts RC | 1:1000 dilution |
| Goat anti-mouse Alexa Fluor 568 secondary antibody | Invitrogen | A-11004 | 1:200 dilution |
| Vectashield mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1500 | |
| Glass coverslips, #1.5 22 x 22 mm | Fisher Scientific | 12-541-B | |
| Microscope slide | Fisher Scientific | 22-038-103 | |
| Nail polish | Elf | Many of the pigments used in nail polishes are fluorescent and leach into specimens. Only clear nail polish should be used. |
References
- Taylor, R. W., Turnbull, D. M. Mitochondrial DNA mutations in human disease. Nat Rev Genet. 6 (5), 389-402 (2005).
- Wallace, D. C., Chalkia, D. Mitochondrial DNA genetics and the heteroplasmy conundrum in evolution and disease. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (11), a021220 (2013).
- Spradling, A. C. . The development of Drosophila melanogaster. , (1993).
- Riechmann, V., Ephrussi, A. Axis formation during Drosophila oogenesis. Curr Opin Genet Dev. 11 (4), 374-383 (2001).
- Lin, H., Yue, L., Spradling, A. C. The Drosophila fusome, a germline-specific organelle, contains membrane skeletal proteins and functions in cyst formation. Development. 120 (4), 947-956 (1994).
- Cox, R. T., Spradling, A. C. A Balbiani body and the fusome mediate mitochondrial inheritance during Drosophila oogenesis. Development. 130 (8), 1579-1590 (2003).
- Davis, A. F., Clayton, D. A. In situ localization of mitochondrial DNA replication in intact mammalian cells. J Cell Biol. 135 (4), 883-893 (1996).
- Iborra, F. J., Kimura, H., Cook, P. R. The functional organization of mitochondrial genomes in human cells. BMC Biol. 2, (2004).
- Rakic, P. Neurogenesis in adult primate neocortex: an evaluation of the evidence. Nat Rev Neurosci. 3 (1), 65-71 (2002).
- Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (7), 2415-2420 (2008).
- Hill, J. H., Chen, Z., Xu, H. Selective propagation of functional mitochondrial DNA during oogenesis restricts the transmission of a deleterious mitochondrial variant. Nat Genet. 46 (4), 389-392 (2014).
- Lentz, S. I., et al. Mitochondrial DNA (mtDNA) Biogenesis: Visualization and Duel Incorporation of BrdU and EdU Into Newly Synthesized mtDNA In Vitro. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 58 (2), 207-218 (2010).
- Tornoe, C. W., Christensen, C., Meldal, M. Peptidotriazoles on solid phase: [1,2,3]-triazoles by regiospecific copper(i)-catalyzed 1,3-dipolar cycloadditions of terminal alkynes to azides. J Org Chem. 67 (9), 3057-3064 (2002).
- Horwitz, H. B., Holt, C. E. Specific inhibition by ethidium bromide of mitochondrial DNA synthesis in physarum polycephalum. J. Cell Biol. 49, 546-553 (1971).
- Huberman, J. A. New views of the biochemistry of eucaryotic DNA replication revealed by aphidicolin, an unusual inhibitor of DNA polymerase alpha. Cell. 23 (3), 647-648 (1981).
- McClung, C., Hirsh, J. Stereotypic behavioral responses to free-base cocaine and the development of behavioral sensitization in Drosophila. Curr Biol. 8 (2), 109-112 (1998).
- Moore, M. S., et al. Ethanol intoxication in Drosophila: Genetic and pharmacological evidence for regulation by the cAMP signaling pathway. Cell. 93 (6), 997-1007 (1998).
- Dzitoyeva, S., Dimitrijevic, N., Manev, H. Gamma-aminobutyric acid B receptor 1 mediates behavior-impairing actions of alcohol in Drosophila: adult RNA interference and pharmacological evidence. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (9), 5485-5490 (2003).
- Koch, E. A., Spitzer, R. H. Multiple effects of colchicine on oogenesis in Drosophila: induced sterility and switch of potential oocyte to nurse-cell developmental pathway. Cell Tissue Res. 228 (1), 21-32 (1983).
