Edu Boyama tarafından Drosophila Yetişkin Yumurtalıkların Mitokondriyal DNA replikasyonu Yerinde Etiketlenmesi içinde
Summary
Drosophila oogenesis continues to be exceptionally useful in the study of mitochondrial proliferation and inheritance. This manuscript describes a detailed protocol used to label the replicating mitochondrial DNA (mtDNA) in Drosophila adult ovaries with 5-ethynyl-2´-deoxyuridine (EdU), which facilitates uncovering mechanisms associated with mitochondrial inheritance that were previously debatable.
Abstract
The mitochondrial genome is inherited exclusively through the maternal line. Understanding of how the mitochondrion and its genome are proliferated and transmitted from one generation to the next through the female oocyte is of fundamental importance. Because of the genetic tractability, and the elegant, ordered simplicity by which oocyte development proceeds, Drosophila oogenesis has become an invaluable system for mitochondrial study. An EdU (5-ethynyl-2´-deoxyuridine) labeling method was utilized to detect mitochondrial DNA (mtDNA) replication in Drosophila ovaries. This method is superior to the BrdU (5-bromo-2′-deoxyuridine) labeling method in that it allows for good structural preservation and efficient fluorescent dye penetration of whole-mount tissues.
Here we describe a detailed protocol for labeling replicating mitochondrial DNA in Drosophila adult ovaries with EdU. Some technical solutions are offered to improve the viability of the ovaries, maintain their health during preparation, and ensure high-quality imaging. Visualization of newly synthesized mtDNA in the ovaries not only reveals the striking temporal and spatial pattern of mtDNA replication through oogenesis, but also allows for simple quantification of mtDNA replication under various genetic and pharmacological perturbations.
Introduction
Nükleer genomu yanı sıra, her ökaryotik hücre de mitokondrial matriks küçük dairesel DNA kopya binlerce içerir. Mitokondriyal DNA (mtDNA) elektron taşıma zincirinin temel alt birimleri kodlar da, çoğaltma ve mtDNA'nın transkripsiyonu için tüm faktörler de dahil olmak üzere mitokondriyal proteom çoğunluğu, nükleer genom tarafından kodlanır. kalıtım Mendel yasaları takip nükleer genom aksine, hayvan mitokondriyal genom anne soyu ile münhasıran kalıtsaldır. Bu nedenle, mtDNA çoğaldı ve kadın oosit yoluyla bir nesilden nasıl iletildiğini anlamak temelde önemlidir. Ancak, mtDNA çoğaltma kadın germline düzenlenmiştir nasıl üzerinde devam eden tartışmalar vardır. Ayrıca, mtDNA iletimi için yaygın olarak kabul mtDNA darboğaz teorisi primordial germ hücrelerinden mtDNA'nın nüfus nispeten az sayıda durin için alt örneklendirilmiştir olduğunu göstermektedirg geliştirme 1 2. Ayrıca mtDNA çoğaltma geçici ve oogenez boyunca uzaysal olarak düzenlenmiş olduğunu ima eder. Bu nedenle, tohum çizgisi gelişimi sırasında mtDNA replikasyon yerinde tespit mtDNA miras mekanizmasının anlaşılması kolaylaştıracaktır.
Drosophila oogenesis mtDNA çoğaltma ve iletim incelemek için bir genetik uysal bir sistem sağlar. İki Drosophila yumurtalıkların her birinde, yumurta üretiminin işlevsel birimler olan ovaryolden 3 olarak adlandırılan yumurta odaları 16-20 bağımsız dizeleri, (Şekil 1A bakınız) vardır. Her bir ovaryol ön uç germarium denilen bir yapı oluşur oogenez, ilerici bir doğrusal organizasyonunu içerir. germarium daha farklı gelişim aşamalarında germ hücreleri içeren dört bölgeye ayrılmıştır. Bölgede 1, germ kök hücreler c olarak bilinen kızı hücreleri üretmek için asimetrik bölünme yoluyla gitmekystoblasts. Bölge 2a nihai bölünme tamamlayan cystoblasts içerir. Cystoblasts bölümü üreten 16-hücre gruplarının dört mermi uğrarlar. 16 hücreleri halka kanalları denilen sitoplazmik köprülerle birbirine bağlı kalır. Diğer 15 polyploid hemşire hücreler olarak geliştirmek ise sadece hücre biri, oosit olarak farklılaşma taahhüt eder. Fusome olarak bilinen önemli bir sitoplazmik yapısı, halka kanalların oluşumu ile kolaylaştırmak kist polarite ve hemşire hücre oosit etkileşimleri 4,5 belirlemek için önerilmektedir. kistler bölge 2b doğru ilerlerken, kist yapıları germarium tüm genişliği boyunca ve daha folikül hücreleri ile ilişkili hale gelir. germarium yapıları ilk tomurcuklanan yumurta odasını içeren bölge 3 ile sona erer. Daha sonra, yumurta odaları 14 morfolojik farklı aşamalarında ovaryol yoluyla ilerleme germarium, arka ucunda monte edilir. oosit büyüme, WH hemşire hücreleri bağlıdırich taşıyıcı proteinler, mRNA ve oosit içine halka kanallarla hücreiçi yapılar (örneğin, Golgi). Drosophila oogenez sırasında, her 16 hücre kist içinde mitokondri bir kısmı fusome ile ilişkili olduğu tespit edilmiştir, halka kanallarından taşındı ve Balbiani gövdesi 6 olarak adlandırılan büyük bir kitle tek oosit içine teslim edildi. Bu olgu kadın yumurtalıkların yoluyla mitokondriyal kalıtım kalite kontrolüne katkıda önerilmiştir.
mtDNA sentezi algılama hücresel DNA'ya işaretli DNA öncülerinin dahil dayanır. Geleneksel olarak, timidin, 5-bromo-2'-deoksiüridin bir nükleosit analoğunun (BrdU), doku kültürü hücreleri 7,8 mtDNA çoğaltma etiketlemek için kullanıldı. Ancak, antikor bazlı BrdU etiketleme özellikle tüm montaj doku boyama, çeşitli sınırlamalar sergiler. BrdU etiketleme bir büyük dezavantajı ortaya çıkarmak için, DNA denatürasyon gerektirmesidirBrdU epitopu, anti-BrdU antikoru ile tespit edilebilir, böylece. Numune, numune yapısını bozar ve boyamanın ardından, Yöntem 9 karmaşıklaştırır gibi kimyasal maddeler (örneğin, hidroklorik asit ya da metanol ve asetik asit karışımı) DNaz ile, ısı ya da sindirim gibi sert denatüre edici şartlar altında muamele edilecek olan 10.
Burada, alternatif bir timidin analog 5-etinil-2'-deoksiüridin (edu), Drosophila ergin yumurtalıklarda replike mitokondriyal DNA etiketlemek için kullanılır. Bu yöntem daha hızlı ve son derece hassastır. Edu hali hazırda DNA replikasyonu sırasında hücresel DNA'ya dahil edilir. Aşağıdaki algılama bir "klik" reaksiyona dayanır, bir Cu (I) 'e, terminal alkin grubu ve bir flüoresan azid 10 ile kovalent reaksiyona, paladyum. Reaksiyon numunenin denatürasyon gerektirmez, çünkü iyi yapısal koruma sağlar. Boya a Ayrıca, boyutzide yalnızca 1/500 tüm montaj dokuların hızlı ve etkili nüfuz eder ve bir antikor molekülünün 10, bu göstermektedir. Biz Drosophila oogenez sırasında mtDNA çoğaltma tespit etmek için bu yöntem kullanılır ve bir çoğaltma bağımlı mtDNA'sının seçici kalıtım mekanizması önermektir bize yol Drosophila yumurtalık 11 germarium bölgede çarpıcı bir mekansal desen, bulduk. Biz burada Drosophila yumurtalıklarda mtDNA çoğaltma edu etiketlenmesi konusunda ayrıntılı bir protokol mevcut. (: Col T300I mt) 11, yanı sıra potansiyel mitokondriyal membran dağıtmak ve potansiyel mtDNA çoğaltma bozmak mitokondriyal eşleşmeyenler, farklı tedavi protokolünün uygulanmasını göstermek için, biz de mtDNA bir mtDNA mutant Drosophila çoğaltma test edilmiştir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Edu markalama yeni sentezlenmiş DNA içine dahil edilmek ve nükleosid analoglarının boyama dayanır çoğalan hücrelere DNA sentezini algılamak için yeni ve etkili bir yöntemdir. Bu yöntem daha hızlı ve çok hassas olduğu BrdU etiketleme yöntemine göre daha üstündür. Daha da önemlisi, 10. Tarihsel olarak, BrdU etiketleme üstün bir alternatif olarak, Edu etiketleme S-fazında nükleer DNA replikasyonu çalışmak için kullanılan, dokular 9-montaj tüm iyi yapısal korunması ve verimli Edu-boya penetrasyonu sağlar Hücre döngüsü. Afidikolin S-fazı 12 ila 15 nükleer DNA replikasyonu için başlıca polimerazdır DNA polimeraz a bir inhibitörüdür. mtDNA çoğaltma tedavi afidikolin hassas olmayan bir DNA polimeraz y, ile gerçekleştirilir. Bu nedenle, öncesinde ve edu inkübasyon sırasında aphidicolin tedavisi önemli ölçüde nükleer DNA'ya edu birleşmesini engellemiştir. Olması gerekiyoruygun depolanmış, ve nükleer DNA replikasyonunu inhibe aphidicolin etkinliği bizim elimizde değişken ise afidikolin birkaç hafta stabil olabilir unutulmamalıdır. Daha fazla veri analizleri gelen güçlü nükleer DNA etiketleme ile ovaryolden veya yumurta odaları ekarte edilmelidir.
mtDNA çoğaltma hali hazırda, aynı zamanda sitoplazma toplam hacmine normalize edu puncta sayısını sayarak mtDNA çoğaltma seviyesini ölçmek için basit bir şekilde elde edilir sitoplazmasmda puncta olarak görselleştirilebilir. Görüntüleme yazılımı otomatik olarak büyük veri kümelerinin hesaplama analizler için özellikle yararlıdır mikroskobik görüntüleri, Edu puncta tanımlamak için uygulanabilir. Nükleer DNA replikasyonu eksik inhibisyonu kromozomu üzerindeki farklı loci Edu dahil yol ve çekirdeğin içinde puncta olarak görüntüleyebilir Ancak, önlemler, önlemler alınmalıdır. Ayrıca diğer durumlarda, Edu yoğunluğu repli katılmadanArka plan ve gürültü yüksek olabilir iken cating mtDNA, zayıf olabilir. Bu nedenle, otomatik görüntü analizleri için, bireysel parametrelerin dikkatle tanımlanmalıdır. Ayrıca görüntülerin doğru edu puncta tanımlanır emin olmak için eğitimli gözlerle ele alınması gerektiğini tavsiye edilir.
Drosophila oogenez sırasında yeni sentezlenmiş mtDNA Görselleştirme mtDNA çoğaltma farmakolojik veya genetik düzensizliklerin çeşitli maruz sinekler deneyi yaparak, fizyolojik veya patolojik koşullar altında düzenlenir nasıl araştırmak için bir fırsat sağlar. Col T300I 11: Daha önceki bir çalışmada, Edu birleşme deneyi bir mtDNA mutant Drosophila mt gerçekleştirildi. Ayrıca, mitokondriyal membran potansiyelini bozmaya, yumurtalık mitokondriyal uncoupler FCCP ya da 2,4-dinitrofenol (DNP) Önceki EDU'ya dahil çeşitli konsantrasyonları ile muamele edildi. deneysel amaçlarla bağlıve ilaç özellikleri, farklı yöntemler etkin verilme için kabul edilebilir. Yetişkin sinekler, ilaç bir buhar (örn, etanol ve kokain) halinde sunulabilir 16,17 ya da ilaçlar hızlı bir şekilde gövde 18 boyunca yayılır karın içine enjekte edilebilir. En yaygın uygulama ilaçlar sinek yiyecek ya da sakaroz / ilaç doymuş filtre kağıdı eklenir olmasıdır. Örneğin, mikrotübül montaj, kolşisin önleyicisi, yumurtalık diseksiyon 19 önce 2-3 gün sinekler beslenmiştir. Bu nedenle, ilaç dağıtım yöntemini değerlendirmek ve uygun konsantrasyonları seçmek önemlidir.
Drosophila yumurtalıklarda mtDNA çoğaltma başarılı görüntüleme sağlamak için, birkaç kritik adımlar dikkatle yürütülmelidir. En önemlisi, diseksiyon ve edu kuruluş sırasında yumurtalıkların canlılığını ve sağlığını korumak esastır (Adım 1 ve 2). FBS ile Schneider Drosophila ortamı oda sıcaklığına ısıtıldı gerekenkullanmadan önce. Bir yumurta odaları ve kesme aletleri veya pipet uçları arasında doğrudan teması en aza indirmek gerekir. Yumurtalıklar dehidratasyonu önlemek için çözümleri altındaki tüm kere dalmış olmalıdır. dokular kolaylıkla yol açabilir ilgilenmedikleri soluk veya floresan sinyalleri. Doku montaj aşaması sırasında, ovaryolden birbirinden ayrılmalıdır ve bir mikroskop lamı üzerine yayılır. Yumurta odasının her biri üst üste yığılırlar ve emin olun. Biz sahnede 14 ötesine yumurta odaları küçük edu dahil edilmesini gösterdiğini fark ettim. Buna ek olarak, çünkü büyük boyutlu, geç dönem yumurta odaları sık sık komşu genç yumurta odaları odak dışına çıkmasına neden. Böylece geç dönem yumurta odaları atılmalıdır tavsiye edilir.
Burada Drosophila yetişkin yumurtalıklarda mtDNA kopyalayan etiketleme için ayrıntılı bir protokol sağlar. Bu yöntem çeşitli genetik ve farmakolojik perturbations altında mtDNA çoğaltma basit ölçümü için izin verir,ve gelişimsel mitokondriyal biyogenezi ve mtDNA miras yatan mekanizmaları diseksiyon için yararlı olacaktır.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank K. Delaney for comments on the manuscript. This work was supported by the National, Heart, Lung, and Blood Institute (NHLBI) Intramural Program.
Materials
| Schneider’s Drosophila medium | Invitrogen | 21720-024 | |
| FBS | Invitrogen | 10100-147 | |
| Pair of Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Aphidicolin | Sigma | A0781 | Aliquot after dissolving in DMSO. Avoid repetitive thawing and freezing. Protect from light. May be used within 6 weeks after dissolving. |
| FCCP | Sigma | C2920 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Paraformaldehyde, 16% EM grade | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Formaldehyde is toxic; it should be handled in a fume hood with skin and eye protection. |
| PBS | KD Medical | RGF-3190 | |
| BSA | Sigma | A7030 | |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
| Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging Kit | Invitrogen | C10337 | EdU, CuSO4, Alexa Fluor 488 azide, EdU reaction buffer and Edu buffer additive are included |
| Mouse ATP synthase subunit α antibody, (15H4C4) | MitoSciences | Ab14748 | 1:1000 dilution |
| Mouse Hts antibody (clone RC) | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | hts RC | 1:1000 dilution |
| Goat anti-mouse Alexa Fluor 568 secondary antibody | Invitrogen | A-11004 | 1:200 dilution |
| Vectashield mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1500 | |
| Glass coverslips, #1.5 22 x 22 mm | Fisher Scientific | 12-541-B | |
| Microscope slide | Fisher Scientific | 22-038-103 | |
| Nail polish | Elf | Many of the pigments used in nail polishes are fluorescent and leach into specimens. Only clear nail polish should be used. |
References
- Taylor, R. W., Turnbull, D. M. Mitochondrial DNA mutations in human disease. Nat Rev Genet. 6 (5), 389-402 (2005).
- Wallace, D. C., Chalkia, D. Mitochondrial DNA genetics and the heteroplasmy conundrum in evolution and disease. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (11), a021220 (2013).
- Spradling, A. C. . The development of Drosophila melanogaster. , (1993).
- Riechmann, V., Ephrussi, A. Axis formation during Drosophila oogenesis. Curr Opin Genet Dev. 11 (4), 374-383 (2001).
- Lin, H., Yue, L., Spradling, A. C. The Drosophila fusome, a germline-specific organelle, contains membrane skeletal proteins and functions in cyst formation. Development. 120 (4), 947-956 (1994).
- Cox, R. T., Spradling, A. C. A Balbiani body and the fusome mediate mitochondrial inheritance during Drosophila oogenesis. Development. 130 (8), 1579-1590 (2003).
- Davis, A. F., Clayton, D. A. In situ localization of mitochondrial DNA replication in intact mammalian cells. J Cell Biol. 135 (4), 883-893 (1996).
- Iborra, F. J., Kimura, H., Cook, P. R. The functional organization of mitochondrial genomes in human cells. BMC Biol. 2, (2004).
- Rakic, P. Neurogenesis in adult primate neocortex: an evaluation of the evidence. Nat Rev Neurosci. 3 (1), 65-71 (2002).
- Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (7), 2415-2420 (2008).
- Hill, J. H., Chen, Z., Xu, H. Selective propagation of functional mitochondrial DNA during oogenesis restricts the transmission of a deleterious mitochondrial variant. Nat Genet. 46 (4), 389-392 (2014).
- Lentz, S. I., et al. Mitochondrial DNA (mtDNA) Biogenesis: Visualization and Duel Incorporation of BrdU and EdU Into Newly Synthesized mtDNA In Vitro. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 58 (2), 207-218 (2010).
- Tornoe, C. W., Christensen, C., Meldal, M. Peptidotriazoles on solid phase: [1,2,3]-triazoles by regiospecific copper(i)-catalyzed 1,3-dipolar cycloadditions of terminal alkynes to azides. J Org Chem. 67 (9), 3057-3064 (2002).
- Horwitz, H. B., Holt, C. E. Specific inhibition by ethidium bromide of mitochondrial DNA synthesis in physarum polycephalum. J. Cell Biol. 49, 546-553 (1971).
- Huberman, J. A. New views of the biochemistry of eucaryotic DNA replication revealed by aphidicolin, an unusual inhibitor of DNA polymerase alpha. Cell. 23 (3), 647-648 (1981).
- McClung, C., Hirsh, J. Stereotypic behavioral responses to free-base cocaine and the development of behavioral sensitization in Drosophila. Curr Biol. 8 (2), 109-112 (1998).
- Moore, M. S., et al. Ethanol intoxication in Drosophila: Genetic and pharmacological evidence for regulation by the cAMP signaling pathway. Cell. 93 (6), 997-1007 (1998).
- Dzitoyeva, S., Dimitrijevic, N., Manev, H. Gamma-aminobutyric acid B receptor 1 mediates behavior-impairing actions of alcohol in Drosophila: adult RNA interference and pharmacological evidence. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (9), 5485-5490 (2003).
- Koch, E. A., Spitzer, R. H. Multiple effects of colchicine on oogenesis in Drosophila: induced sterility and switch of potential oocyte to nurse-cell developmental pathway. Cell Tissue Res. 228 (1), 21-32 (1983).
