Tespiti için daha duyarlı ve özgül Chromogenic Agar Orta Gelişimi<em> Vibrio parahaemolyticus</em> Ve Diğer<em> Vibrio</em> Türler
Summary
Detection and isolation of clinically relevant Vibrio species require selective and differential culture media. This study evaluated the ability of a new chromogenic medium to detect and identify V. parahaemolyticus and other related species. The new medium was found to have better sensitivity and specificity than the conventional medium.
Abstract
Vibrio türlerinin neden olduğu ABD'de Gıda kaynaklı enfeksiyonlar artış eğilimine göstermiştir. Cins Vibrio, V. parahaemolyticus Vibrio -associated enfeksiyonların çoğunluğu sorumludur. Böylece, Vibrio türleri arasında doğru farklılaşma. ve V. algılama parahaemolyticus gıda arzının güvenliğini sağlamak için büyük önem taşımaktadır. moleküler teknikler giderek daha yaygın olmakla birlikte, kültür-bağlı yöntemleri hala rutin yapılır ve bunlar bazı durumlarda standart yöntemler olarak kabul edilir. Bu nedenle, yeni bir kromojenik agar ortamı izolasyon ve klinik olarak anlamlı Vibrio spp farklılaşması için daha iyi bir yöntem sağlamak amacı ile test edilmiştir. Protokol V. tespiti için duyarlılık, özgüllük ve algılama limitini karşılaştırıldı Yeni kromojenik orta ve geleneksel bir ortam arasında parahaemolyticus. Çeşitli V. parahaemolyticus suşları (n = 22), yenidenfarklı serotipleri ve kökenlerden kaynağını sunan kullanılmıştır. Daha önce Gıda ve İlaç Dairesi (FDA) ve Hastalık Kontrol ve Önleme Merkezleri (CDC) tarafından tanımlanan ve ayrıca tlh -PCR tarafından laboratuvarda doğrulanmıştır. En az dört ayrı deneylerde, bu suşlara 24 için 35-37 ° C 'de inkübasyon takip kromojenik agar tiyosülfat-sitrat safra tuzları sakaroz, bu tür kültürlenmesi için tavsiye edilen orta (TCBS) ağar, üzerine aşılanmıştır -96 saat. Üç V. Büyüme varsa parahaemolyticus suşları (% 13.6) yine, TCBS üzerinde optimum büyümek yeşil koloniler sergiledi vermedi. İki suş (% 9.1) kromojenik agar üzerinde beklenen camgöbeği kolonileri vermemiştir. Olmayan V. parahaemolyticus suşları (n = 32), aynı zamanda kromojenik agar özgünlüğünü belirlemek için test edildi. Bu suşların arasında, 31 büyüyecek ya da diğer koloni morfolojileri sergilenmektedir vermedi. V. ortalama geri chromoge üzerinde parahaemolyticusnic Agar ~% 2 NaCl ile desteklenmiş triptik soya agar% 96.4 akrabasıydı. Sonuç olarak, yeni kromojenik ağar V. algılamak için etkili bir orta parahaemolyticus ve vibrios ayırmak için.
Introduction
Vibrio cinsi, V. bir üyesi olarak parahaemolyticus Gram negatif, spor oluşturan eğik, çubuk şeklinde bir bakteridir. Sıvı ve yarı-katı ortamları yüksek hareketliliğini göstermektedir. Çoğu V. parahaemolyticus suşları insanlara patojenik olmayan, henüz patojen alt tipi bir çok ülkede 1,2 dolayısıyla bu türün önemli gıda kaynaklı patojen olarak kabul edilir salgınlara, yol açmıştır. ABD'de Vibrio enfeksiyon insidansı 2000 3 itibaren artış eğilimi göstermiştir. Vibrio spp arasında., V. parahaemolyticus ABD 4,5 yılında hastalıklara neden olan en sık bildirilen türdür. Diğer klinik olarak anlamlı türler V. dahil alginolyticus'un, V. vulnificus, V. cholerae vb hastalıkların küçük bir yüzdesi, aynı anda birden fazla türün neden olur.
V. parahaemolyticus doğal iDeniz suyu nhabitant ve bu nedenle yaygın olarak haliç dahil olmak üzere dünya çapında deniz sularında dağıttı. türler Japonya'da gıda zehirlenmesi salgını aşağıdaki 1950 yılında keşfedildi. ABD'de, türler ilk Puget Sound bölgesinde 6,7 deniz suyu, sediment, ve kabuklu deniz ürünleri izole edildi. Böyle çift kabuklu kabuklu deniz ürünleri gibi deniz habitatlarının, Filtre besleyiciler, V. liman olabilir doğal floranın 8 parçası olarak parahaemolyticus. Bu, V. olarak İnsanda parahaemolyticus enfeksiyonları genellikle kontamine deniz ürünleri, özellikle çiğ veya az pişmiş kabuklu deniz ürünleri tüketimi ile bağlantılıdır. açık yara cilt enfeksiyona yol açan, deniz suyuna maruz kaldığında giriş Daha az yaygın yol meydana gelir. Çoğu V. parahaemolyticus suşları insan hastalığına neden olmaz, henüz böyle termostabil doğrudan hemolizin (TDH) olarak virülans faktörleri barındıran bazı alt tipler patojenik bulunmaktadır. Gıda kaynaklı V. en yaygın belirtileri parahaemolyticus enfeksiyonubulantı, kusma ve ateş takip ishal ve karın ağrısı. Baş ağrısı ve titreme de bildirilmiştir. Medyan kuluçka süresi 15 saat, ama patojenik 9 yeterli miktarda tüketiminden sonra 96 saat olabilir. hastalık iki üç gün sürer. V. neden gastroenterit belirtileri parahaemolyticus büyük ölçüde kendi kendini sınırlayıcı değildir ve bu yüzden, özel bir tedavi gerekli değildir. gastroenterit Hafif vakalarda etkin bir ağızdan rehidrasyon ile tedavi edilebilir. Daha ağır hastalıklar tetrasiklin veya siprofloksasin 10 antibiyotikler ile tedavi edilebilir. Ölüm oranı gastroenterit vakaların yaklaşık% 2, ancak kan dolaşımı enfeksiyonu veya septisemi geliştirmek isteyenler için% 29 gibi yüksek olabilir. Deniz suyuna maruz kalan açık yara deniz tüketir veya sahip herhangi bir kişi V. riski altındadır parahaemolyticus enfeksiyon. hastalıklar, yaşamı tehdit eden septisemi daha şiddetli formu, altta yatan tıbbi işbirliği ile bir alt grubunda daha sık görülüralkolizm, karaciğer hastalığı, diyabet, böbrek hastalığı, malignansi ve zayıflamış bağışıklık tepkisi veren diğer sağlık durumları arasında olan şulları 11. Özellikle, bireylerin bu grup V. neden ağır hastalıklara yakalanma için daha yüksek risk altındadır da V. benzer doğal habitatların bulunabilir vulnificus, parahaemolyticus.
V. parahaemolyticus rutin seçici ve ayırıcı araç olarak tiyosülfat-sitrat safra tuzları sakaroz (TCBS) agarı kullanılarak izole edilir. Alkali pepton suda zenginleştirilmesi TCBS agarda izolasyon önce ortaya çıkabilir. TCBS ilgili olası koloniler daha sonra türe özgü genlerin varlığı hedefleme biyokimyasal testler ve / veya moleküler yöntemler bir dizi test edilir. PCR bazlı yöntemler genellikle V kimliklerini teyit etmek için kullanılan 12 tlh, termal olarak hemolisin geni yükselterek parahaemolyticus.
Ne olursa olsun chOnay yöntemlerinin Ses Bildirim, o V. izole etmek ve ayırt etmek için etkili bir ortam olması önemlidir ilk etapta diğer deniz vibrios gelen parahaemolyticus. TCBS rutin sakaroz 12 mayalanmaya kendi yeteneklerine göre Vibrio cinsi içinde türlerin ayırt etmek için kullanılır olmuştur. Pozitif fermantasyon reaksiyon pH indikatör bromtimol mavi bir renk değişikliği ile eşlik ediyor. V. parahaemolyticus koloniler yeşil renk mavi sergileyen TCBS üzerinde oldukça belirgindir. Ancak, bu orta kolaylıkla V. ayırt edemez alginolyticus'un ve V. cholerae. Sakkaroz fermente Proteus türleri V. benzeyen sarı koloniler oluşturabilir cholerae veya V'dir alginolyticus'un 13. TCBS, V. başlangıç izolasyon üzerine parahaemolyticus da Aeromonas hydrophila, Plesiomonas shigelloides, ve Pseudomonas spp 14 olarak misidentified olabilir. gecikmiş sakaroz halden ile suşlarıentation V. dahil Vibrio 13 fermente diğer sakaroz ile karışabilir parahaemolyticus. TCBS diğerleri arasında Escherichia coli, Pseudomonas putrefaciens'in karşı değil, duyarlı olduğu tespit edilmiştir. Birkaç diğer türler potansiyel V ile karıştırılmamalıdır gri koloniler yeşil verim parahaemolyticus ya da V. vulnificus 15. Bunun bir sonucu olarak, tespit ve V izole karşı daha iyi hassasiyet ve özgüllük ile alternatif bir kültür ortamı geliştirilmesi arzu edilmektedir parahaemolyticus ve diğerlerinin yanında yakın ilişkili tür.
Çeşitli medya alternatifleri son zamanlarda geliştirilmiştir. Seçici maddelerin dahil edilmesi ek olarak, en ayırıcı enzimsel faaliyetlerin göre türlerin ayırt etmek için kromojenik substratlar içermektedir. Örneğin, indoksil-β-glukozit ve indoksil-β-galaktozid V ayırt etmek için kromojenik substratlar olarak kullanılmaktadır paragrafV. olanlardan (mavimsi-yeşil görünür) haemolyticus kolonileri nedeniyle diferansiyel yetenekleri (mor) cholerae β-glukozidaz ve β-galaktosidaz 16 üretmek. Çeşitli gruplar tarafından geliştirilen kromojenik agar Farklı formülasyonları değerlendirilmiştir ve nispeten veya TCBS 17,18,19 daha iyi performans bildirilmiştir. kromojenik ortam kullanmanın bir avantajı, çevreleyen ortamın renk ve böylece belirli bir koloni izolasyonu kolaylaştırmak az olmasıdır. Bu çalışmada, V tespit etmek ve izole etmek için yeni formüle kromojenik ortamın yeteneği değerlendirildi cholerae, V. parahaemolyticus ve V. vulnificus; V. ayırt etme yeteneği üzerine özel bir odaklanma ile Diğer türlerden parahaemolyticus.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu çalışma kültür ortamı geliştirilmesi ve değerlendirilmesi üzerinde duruluyor. Geleneksel olarak, TCBS olan seçici ve orta V izole ve tespit etmek için kullanılan diferansiyel parahaemolyticus, V. cholerae ve V. vulnificus 12. Ancak, kısıtlamalar gibi V. ayrım yapamama olarak, bu ortam için rapor edilmiştir Diğer Vibrio cholerae türlerden. Sakaroz ve pH göstergesi TCBS farklılaşması maddelerdir. Böylece, sukroz fermentasyon cihaz?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz proje üzerinde kendi yardım için M. Channey, E. Chau, ve K. Tomas teşekkür ederiz. Proje malzemeleri kısmen California Polytechnic State Üniversitesi tarafından finanse edilmiştir.
Materials
| Reagent/Equipment | |||
| Agar | Fisher Scientific | DF0140-15-4 | may use other brands |
| Autoclave | Any | ||
| BHI powder | Fisher Scientific | DF0418-17-7 | may use other brands |
| Blender | Any | to blend oyster meat | |
| CampyGen gas generator | Hardy Diagnostics | CN035A | to provide a microaerophilic atmosphere; may use other brands |
| Chocolate agar plates | Hardy Diagnostics | E14 | may use other brands |
| Common PCR reagents (dNTPs, MgCl2, Taq Polymerase) | Any | or use PCR beads (Fisher Sci 46-001-014) | |
| Culture tubes | Fisher Scientific | S50712 | may use other brands |
| Eppendorf tubes | Fisher Scientific | S348903 | may use other brands |
| Gel doc | Any | ||
| HardyChrom Vibrio agar plates | Hardy Diagnostics | G319 | This study evaluates this medium |
| Incubator | Any | ||
| Inoculating loops | Fisher Scientific | 22-363-606 | 10 microliter-size was used in this study |
| NaCl | Fisher Scientific | BP358-212 | may use other brands |
| Oysters | Any | ||
| PBS | Fisher Scientific | R23701 | may use other brands |
| Petri dish | Fisher Scientific | FB0875713 | may use other brands |
| Pipette and tips | Any | Sterilized tips | |
| Primers for tlh | IDT DNA | ||
| Scale | Any | ||
| Spreader | Fisher Scientific | 08-100-11 | Beads may be used instead |
| Stomacher blender | Stomacher | 400 | Samples were homogenized at 200 rpm for 30 sec. Other homogenizer can be used. |
| Sterile filter bags for blenders | Fisher Scientific | 01-812-5 | |
| TCBS powder | Hardy Diagnostics | 265020 | This study evaluates this medium |
| Thermocycler | Any | ||
| TSB powder | Fisher Scientific | DF0370-07-5 | may use other brands |
| UV viewing cabinet | Any | Emit long-wave UV light | |
| Water bath | Any | ||
| Name | Sources | Catalog Number | Comments |
| Bacterial species and strains | |||
| Aeromonas hydrophila | ATCC | ||
| Candida albicans | ATCC | ||
| Campylobacter jejuni | ATCC | ||
| Escherichia coli | ATCC | ||
| Proteus mirabilis | ATCC | ||
| Pseudomonas aeruginosa | ATCC | ||
| Staphylococcus aureus | ATCC | ||
| Salmonella Choleraesuis | ATCC | ||
| Shigella boydii | ATCC | ||
| Shigella flexneri | ATCC | ||
| Shigella sonnei | ATCC | ||
| Vibrio alginolyticus | ATCC | ||
| V. cholerae (serotypes include O139, O1, non O1, El Tor biovars) | FDA, ATCC | ||
| V. damsela | FDA | ||
| V. fisherii | Environment | ||
| V. fluvialis | CDC | ||
| V. furnissii | CDC | ||
| V. hollisae | FDA | ||
| V. metschnikovii | ATCC | ||
| V. mimicus | FDA | ||
| V. parahaemolyticus(serotypes include O3:K6, O1:K56, O4:K8, O5:K15, O8, etc) | ATCC, FDA, CDC, Environment | ||
| V. proteolyticus | FDA | ||
| V. vulnificus | FDA |
References
- Yeung, P. S., Boor, K. J. Epidemiology, pathogenesis, and prevention of foodborne Vibrio parahaemolyticus infections. Foodborne Pathog. Dis. 1 (2), 74-88 (2004).
- Yeung, P. S. M., Boor, K. J., Faruque, S. M. Epidemiology, molecular biology, and detection of foodborne Vibrio parahaemolyticus infections. Foodborne and Waterborne Bacterial pathogens: Epidemiology, Evolution and Molecular Biology. , 153-184 (2012).
- Centers for Disease Control and Prevention. Vital Signs: Incidence and Trends of Infection with Pathogens Transmitted Commonly Through Food – Foodborne Diseases Active Surveillance Network, 10 U.S. Sites, 1996-2010. Morbidity and Mortality Weekly Report. 10, 1996-2010 (2011).
- . Summary of human Vibrio cases reported to CDC, 2008 Available from: https://stacks.cdc.gov/view/cdc/21591 (2008)
- Scallan, E., et al. Foodborne illness acquired in the United States – major pathogens. Emerg. Infect. Dis. 17 (1), 7-15 (2011).
- Baross, J., Liston, J. Occurrence of Vibrio parahaemolyticus and related hemolytic vibrios in marine environments of Washington State. Appl. Microbiol. 20 (2), 179-186 (1970).
- Baross, J., Liston, J. Isolation of Vibrio parahaemolyticus from the Northwest Pacific. Nature. 217 (5135), 1263-1264 (1968).
- Kueh, C. S., Chan, K. Y. Bacteria in bivalve shellfish with special reference to the oyster. J. Appl. Bacteriol. 59 (1), 41-47 (1985).
- Food and Drug Administration. . Bad Bug Book, Foodborne Pathogenic Microorganisms and Natural Toxins. , (2012).
- Qadri, F., et al. Adaptive and inflammatory immune responses in patients infected with strains of Vibrio parahaemolyticus. J. Infect. Dis. 187 (7), 1085-1096 (2003).
- MacFaddin, J. F. . Media for isolation-cultivation-identification-maintenance of medical bacteria. 1, (1985).
- Bottone, E. J., Robin, T. Vibrio parahaemolyticus: suspicion of presence based on aberrant biochemical and morphological features. J. Clin. Microbiol. 8 (6), 760-763 (1978).
- Lotz, M. J., Tamplin, M. L., Rodrick, G. E. Thiosulfate-citrate-bile salts-sucrose agar and its selectivity for clinical and marine vibrio organisms. Ann. Clin. Lab. Sci. 13 (1), 45-48 (1983).
- Hara-Kudo, Y., Nishina, T., Nakagawa, H., Konuma, H., Hasegawa, J., Kumagai, S. Improved method for detection of Vibrio parahaemolyticus in seafood. Appl. Environ. Microbiol. 67 (12), 5819-5823 (2001).
- Eddabra, R., Piemont, Y., Scheftel, J. M. Evaluation of a new chromogenic medium, chromID Vibrio, for the isolation and presumptive identification of Vibrio choleare and Vibrio parahaemolyticus from human clinical specimens. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 30 (6), 733-737 (2011).
- Kodaka, H., Teramura, H., Mizuochi, S., Saito, M., Matsuoka, H. Evaluation of the Compact Dry VP method for screening raw seafood for total Vibrio parahaemolyticus. J. Food. Prot. 72 (1), 169-173 (2009).
- Su, Y. C., Duan, J., Wu, W. H. Selectivity and specificity of a chromogenic medium for detecting Vibrio parahaemolyticus. J. Food Prot. 68 (7), 1454-1456 (2005).
- Bej, A. K., Patterson, D. P., Brasher, C. W., Vickery, M. C., Jones, D. D., Kaysner, C. A. Detection of total and hemolysin-producing Vibrio parahaemolyticus in shellfish using multiplex PCR amplification of tl, tdh and trh. J. Microbiol. Methods. 36 (3), 215-225 (1999).
- Yeung, P. S. M., DePaola, A., Kaysner, C. A., Boor, K. J. A PCR assay for specific detection of the pandemic Vibrio parahaemolyticus O3:K6 clone from shellfish. J. Food Sci. 68 (4), 1459-1466 (2003).
- Yeung, P. S. M., Hayes, M. C., DePaola, A., Kaysner, C. A., Kornstein, L., Boor, K. J. Comparative phenotypic, molecular, and virulence characterization of Vibrio parahaemolyticus O3:K6 isolates. Appl. Environ. Microbiol. 68 (6), 2901-2909 (2002).
- Duan, J., Su, Y. -. C. Comparison of a chromogenic medium with thiosulfate-citrate-bile salts-sucrose agar for detecting Vibrio parahaemolyticus. J. Food Sci. 70, M125-M128 (2005).
- Pinto, A. D., Terio, V., Novello, L., Tantillo, G. Comparison between thiosulphate-citrate-bile salt sucrose (TCBS) agar and CHROMagar Vibrio for isolating Vibrio parahaemolyticus. Food Control. 22 (1), 124-127 (2011).
- Canizalez-Roman, A., Flores-Villaseñor, H., Zazueta-Beltran, J., Muro-Amador, S., Leòn-Sicairos, N. Comparative evaluation of a chromogenic agar medium-PCR protocol with a conventional method for isolation of Vibrio parahaemolyticus strains from environmental and clinical samples. Can J Microbiol. 57 (2), 136-142 (2011).
- Kriem, M. R., et al. Prevalence of Vibrio spp. in raw shrimps (Parapenaeus longirostris) and performance of a chromogenic medium for the isolation of Vibrio strains. Lett Appl Microbiol. 61 (3), 224-230 (2015).
- Food Drug Administration. Statistical guidance on reporting results from studies evaluating diagnostic tests. http://www.fda.gov/RegulatoryInformation/Guidances/ucm071148.htm. , (2007).
- Burd, E. M. Validation of laboratory-developed molecular assays for infectious diseases. Clin Microbiol Rev. 23 (3), 550-576 (2010).
