Ontwikkeling van een meer gevoelige en specifieke Chromogenic Agar Medium voor de detectie van<em> Vibrio parahaemolyticus</em> En andere<em> Vibrio</em> Species
Summary
Detection and isolation of clinically relevant Vibrio species require selective and differential culture media. This study evaluated the ability of a new chromogenic medium to detect and identify V. parahaemolyticus and other related species. The new medium was found to have better sensitivity and specificity than the conventional medium.
Abstract
Voedselinfecties in de Verenigde Staten, veroorzaakt door Vibrio soorten hebben laten zien een stijgende trend. In het genus Vibrio, V. parahaemolyticus is verantwoordelijk voor het merendeel van Vibrio geassocieerde infecties. Aldus nauwkeurige differentiatie bij Vibrio spp. en detectie van V. parahaemolyticus is van cruciaal belang voor de veiligheid van onze voedselvoorziening te waarborgen. Hoewel moleculaire technieken worden steeds vaker worden kweek afhankelijk methoden nog routinematig en ze worden beschouwd standaardwerkwijzen onder bepaalde omstandigheden. Daarom werd een nieuwe chromogene agar medium getest met als doel het bieden van een betere werkwijze voor isolatie en differentiatie van klinisch relevante Vibrio spp. Het protocol vergeleken de sensitiviteit, specificiteit en detectielimiet voor de detectie van V. parahaemolyticus tussen de nieuwe chromogene medium en een conventioneel medium. Diverse V. parahaemolyticus stammen (n = 22) rede presentatie van diverse serotypes en de bron van oorsprong werden gebruikt. Zij werden eerder geïdentificeerd door de Food and Drug Administration (FDA) en de Centers for Disease Control and Prevention (CDC), en door TLH -PCR in ons laboratorium verder geverifieerd. In ten minste vier afzonderlijke onderzoeken werden deze stammen geënt op de chromogene agar en thiosulfaat-citraat-galzouten sucrose (TCBS) agar, is de aanbevolen medium voor het kweken van deze soort, gevolgd door incubatie bij 35-37 ° C gedurende 24 -96 uur. Drie V. parahaemolyticus stammen (13,6%) niet optimaal groeien op TCBS, toch tentoongesteld groene koloniën als er groei. Twee stammen (9,1%) niet de verwachte cyaan kolonies opleveren op het chromogene agar. Niet- V. parahaemolyticus stammen (n = 32) werden ook getest om de specificiteit van het chromogene agar te bepalen. Onder deze stammen, 31 niet groeien of tentoongesteld andere kolonie morfologie. De gemiddelde herstel van de V. parahaemolyticus op de chromogenic agar was ~ 96,4% betrokken op tryptische soja-agar gesupplementeerd met 2% NaCl. Concluderend, de nieuwe chromogene agar is een effectief medium te detecteren V. parahaemolyticus en het te onderscheiden van andere vibrio.
Introduction
Als lid van het genus Vibrio, V. parahaemolyticus is een Gram-negatieve, niet-sporen-vormende, gebogen, staafvormige bacterie. Vertoont hoge motiliteit in zowel vloeibare en halfvaste omgevingen. De meeste V. parahaemolyticus stammen zijn niet-pathogeen voor mensen, maar de pathogene subtypen veroorzaakt epidemieën en pandemieën, waardoor deze soort wordt beschouwd als een belangrijke voedselpathogeen in veel landen 1,2. De incidentie van Vibrio infectie in de VS heeft een stijgende trend sinds 2000 3. Onder Vibrio spp., V. parahaemolyticus is de meest frequent gemelde soorten veroorzaken ziekten in de VS 4,5. Andere klinisch relevante soorten zijn V. alginolyticus, V. vulnificus, V. cholerae, etc. Een klein percentage van de ziekte wordt veroorzaakt door meerdere soorten tegelijk.
V. parahaemolyticus is een natuurlijke inhabitant van zeewater en dus op grote schaal verspreid in mariene wateren over de hele wereld met inbegrip van de estuaria. De soort werd ontdekt in 1950 na een uitbraak van voedselvergiftiging in Japan. In de VS werd de soort voor het eerst geïsoleerd in zeewater, sedimenten en schelpdieren in de Puget Sound regio 6,7. Filtervoeders in mariene habitats, zoals tweekleppige schelpdieren, kan haven V. parahaemolyticus als onderdeel van hun natuurlijke flora 8. Als zodanig V. parahaemolyticus infecties bij de mens zijn vaak gekoppeld aan de consumptie van besmette vis, vooral rauw of onvoldoende verhit schelpdieren. Een minder gebruikelijke route van binnenkomst optreedt wanneer open wond wordt blootgesteld aan zeewater, waardoor huidinfectie. De meeste V. parahaemolyticus spanningen veroorzaken geen ziekte bij de mens, maar toch bepaalde subtypen herbergen virulentie factoren, zoals thermostabiel direct hemolysine (TDH) zijn pathogeen. De meest voorkomende symptomen van voedselvergiftiging V. parahaemolyticus infectiediarree en buikpijn, gevolgd door misselijkheid, braken, en koorts. Hoofdpijn en koude rillingen zijn ook gemeld. De mediane incubatietijd is 15 uur, maar kan tot 96 uur na consumptie van voldoende hoeveelheid pathogene stammen 9. De ziekte duurt twee tot drie dagen. De gastro symptomen veroorzaakt door V. parahaemolyticus grotendeels zelfbeperkend en daarom speciale behandeling niet nodig. Milde gevallen van gastro-enteritis kunnen worden behandeld door orale rehydratie. Ernstigere ziekten kunnen worden behandeld met antibiotica zoals tetracycline en ciprofloxacine 10. Sterftecijfer ongeveer 2% voor gastro gevallen, maar kan oplopen tot 29% voor die septicemie of sepsis ontwikkelen. Elke persoon die vis consumeert of heeft open wond blootgesteld aan zeewater is het risico van V. parahaemolyticus infectie. De ernstigere vorm van ziekten, levensbedreigende septikemie, komt vaker voor bij een subpopulatie met onderliggende medische conditions 11, die alcoholisme, leverziekte, diabetes, nierziekte, maligniteit en andere omstandigheden die leiden tot een verzwakte immuunrespons omvatten. Met name deze groep van individuen is ook op een hoger risico voor het oplopen van ernstige ziekten veroorzaakt door V. vulnificus, die kan worden gevonden in vergelijkbaar met V. natuurlijke habitats parahaemolyticus.
V. parahaemolyticus wordt routinematig geïsoleerd met behulp van thiosulfaat-citraat-galzouten-sucrose (TCBS) agar als een selectieve en differentiële medium. Verrijking in alkalisch peptonwater kan isolatie voorafgaan op TCBS agar. Vermoedelijke kolonies op TCBS worden verder getest in een reeks van biochemische tests en / of moleculaire assays gericht op de aanwezigheid van soortspecifieke genen. PCR-gebaseerde werkwijzen worden vaak gebruikt om de identiteit van V. bevestigen parahaemolyticus door het versterken van de thermolabiele hemolysin gen, TLH 12.
Ongeacht de lOICE van bevestigingsmethoden, is het belangrijk om een effectief medium te isoleren en te differentiëren V. hebben parahaemolyticus van andere mariene vibrio's in de eerste plaats. TCBS is routinematig gebruikt om soorten differentiëren binnen de genus Vibrio naar vermogen om sucrose 12 gisten. Positieve fermentatie gepaard gaat met een kleurverandering van de pH-indicator broomthymolblauw. V. parahaemolyticus kolonies zijn vrij onderscheidend op TCBS, tentoonstellen blauw naar groen kleur. Dit kan echter niet gemakkelijk onderscheiden medium V. alginolyticus en V. cholerae. sucrose fermenteren Proteus soorten kunnen gele kolonies die lijkt V. produceren cholerae of V. alginolyticus 13. Bij de eerste isolatie op TCBS, V. parahaemolyticus kan ook worden ten onrechte aangemerkt als Aeromonas hydrophila, Plesiomonas shigelloides en Pseudomonas spp 14. Stammen met vertraagde sucrose fermentatie kan worden verward met andere sucrose nonfermenting Vibrio 13, die onder meer V. parahaemolyticus. TCBS bleek ongevoelig tegen Escherichia coli, Pseudomonas putrefaciens, onder anderen. Verscheidene andere soorten op groen naar grijs kolonies die mogelijk worden verward met V. parahaemolyticus of V. vulnificus 15. Dientengevolge is het wenselijk om alternatieve kweekmedia ontwikkelen betere gevoeligheid en specificiteit richting detecteren en isoleren V. parahaemolyticus en andere nauw verwante soorten.
Verschillende media alternatieven zijn recent ontwikkeld. Naast het opnemen van selectiemiddelen meeste nemen chromogene substraten soorten onderscheiden op basis van hun differentiële enzymatische activiteiten. Bijvoorbeeld zijn indoxyl-β-glucoside en indoxyl-β-galactoside gebruikt als chromogene substraten V. differentiëren parahaemolyticus kolonies (die blauw-groen weergegeven) van die van V. cholerae (paars) vanwege hun differentiële vermogen om β-glucosidase en β-galactosidase 16 te produceren. Verschillende formuleringen van chromogene agar ontwikkeld door verschillende groepen onderzocht en gerapporteerd vergelijkbaar of beter dan TCBS 17,18,19 te voeren. Een voordeel van het gebruik van een chromogeen medium is dat het kleuren van het omringende medium minimaal is waardoor de isolatie van bepaalde kolonies vergemakkelijkt. In dit onderzoek onderzochten we de mogelijkheid van een nieuw geformuleerde chromogeen medium voor detecteren en isoleren V. cholerae, V. parahaemolyticus en V. vulnificus; met een speciale focus op het vermogen om onderscheid te maken V. parahaemolyticus van andere soorten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit onderzoek richt zich op de ontwikkeling en evaluatie van de cultuur media. Conventioneel TCBS is het selectief en differentieel medium voor de isolatie en het detecteren V. parahaemolyticus, V. cholerae en V. vulnificus 12. Echter zijn beperkingen gerapporteerd voor dit medium, zoals het onvermogen om onderscheid V. cholerae uit andere Vibrio. Sucrose en pH-indicator zijn de differentiatie agenten van TCBS. Aldus zuurproductie sucrose fermentor veroorzaakt kleurverander…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken M. Channey, E. Chau, en K. Tomas voor hun hulp aan het project. Project leveringen werden gedeeltelijk gefinancierd door de California Polytechnic State University.
Materials
| Reagent/Equipment | |||
| Agar | Fisher Scientific | DF0140-15-4 | may use other brands |
| Autoclave | Any | ||
| BHI powder | Fisher Scientific | DF0418-17-7 | may use other brands |
| Blender | Any | to blend oyster meat | |
| CampyGen gas generator | Hardy Diagnostics | CN035A | to provide a microaerophilic atmosphere; may use other brands |
| Chocolate agar plates | Hardy Diagnostics | E14 | may use other brands |
| Common PCR reagents (dNTPs, MgCl2, Taq Polymerase) | Any | or use PCR beads (Fisher Sci 46-001-014) | |
| Culture tubes | Fisher Scientific | S50712 | may use other brands |
| Eppendorf tubes | Fisher Scientific | S348903 | may use other brands |
| Gel doc | Any | ||
| HardyChrom Vibrio agar plates | Hardy Diagnostics | G319 | This study evaluates this medium |
| Incubator | Any | ||
| Inoculating loops | Fisher Scientific | 22-363-606 | 10 microliter-size was used in this study |
| NaCl | Fisher Scientific | BP358-212 | may use other brands |
| Oysters | Any | ||
| PBS | Fisher Scientific | R23701 | may use other brands |
| Petri dish | Fisher Scientific | FB0875713 | may use other brands |
| Pipette and tips | Any | Sterilized tips | |
| Primers for tlh | IDT DNA | ||
| Scale | Any | ||
| Spreader | Fisher Scientific | 08-100-11 | Beads may be used instead |
| Stomacher blender | Stomacher | 400 | Samples were homogenized at 200 rpm for 30 sec. Other homogenizer can be used. |
| Sterile filter bags for blenders | Fisher Scientific | 01-812-5 | |
| TCBS powder | Hardy Diagnostics | 265020 | This study evaluates this medium |
| Thermocycler | Any | ||
| TSB powder | Fisher Scientific | DF0370-07-5 | may use other brands |
| UV viewing cabinet | Any | Emit long-wave UV light | |
| Water bath | Any | ||
| Name | Sources | Catalog Number | Comments |
| Bacterial species and strains | |||
| Aeromonas hydrophila | ATCC | ||
| Candida albicans | ATCC | ||
| Campylobacter jejuni | ATCC | ||
| Escherichia coli | ATCC | ||
| Proteus mirabilis | ATCC | ||
| Pseudomonas aeruginosa | ATCC | ||
| Staphylococcus aureus | ATCC | ||
| Salmonella Choleraesuis | ATCC | ||
| Shigella boydii | ATCC | ||
| Shigella flexneri | ATCC | ||
| Shigella sonnei | ATCC | ||
| Vibrio alginolyticus | ATCC | ||
| V. cholerae (serotypes include O139, O1, non O1, El Tor biovars) | FDA, ATCC | ||
| V. damsela | FDA | ||
| V. fisherii | Environment | ||
| V. fluvialis | CDC | ||
| V. furnissii | CDC | ||
| V. hollisae | FDA | ||
| V. metschnikovii | ATCC | ||
| V. mimicus | FDA | ||
| V. parahaemolyticus(serotypes include O3:K6, O1:K56, O4:K8, O5:K15, O8, etc) | ATCC, FDA, CDC, Environment | ||
| V. proteolyticus | FDA | ||
| V. vulnificus | FDA |
References
- Yeung, P. S., Boor, K. J. Epidemiology, pathogenesis, and prevention of foodborne Vibrio parahaemolyticus infections. Foodborne Pathog. Dis. 1 (2), 74-88 (2004).
- Yeung, P. S. M., Boor, K. J., Faruque, S. M. Epidemiology, molecular biology, and detection of foodborne Vibrio parahaemolyticus infections. Foodborne and Waterborne Bacterial pathogens: Epidemiology, Evolution and Molecular Biology. , 153-184 (2012).
- Centers for Disease Control and Prevention. Vital Signs: Incidence and Trends of Infection with Pathogens Transmitted Commonly Through Food – Foodborne Diseases Active Surveillance Network, 10 U.S. Sites, 1996-2010. Morbidity and Mortality Weekly Report. 10, 1996-2010 (2011).
- . Summary of human Vibrio cases reported to CDC, 2008 Available from: https://stacks.cdc.gov/view/cdc/21591 (2008)
- Scallan, E., et al. Foodborne illness acquired in the United States – major pathogens. Emerg. Infect. Dis. 17 (1), 7-15 (2011).
- Baross, J., Liston, J. Occurrence of Vibrio parahaemolyticus and related hemolytic vibrios in marine environments of Washington State. Appl. Microbiol. 20 (2), 179-186 (1970).
- Baross, J., Liston, J. Isolation of Vibrio parahaemolyticus from the Northwest Pacific. Nature. 217 (5135), 1263-1264 (1968).
- Kueh, C. S., Chan, K. Y. Bacteria in bivalve shellfish with special reference to the oyster. J. Appl. Bacteriol. 59 (1), 41-47 (1985).
- Food and Drug Administration. . Bad Bug Book, Foodborne Pathogenic Microorganisms and Natural Toxins. , (2012).
- Qadri, F., et al. Adaptive and inflammatory immune responses in patients infected with strains of Vibrio parahaemolyticus. J. Infect. Dis. 187 (7), 1085-1096 (2003).
- MacFaddin, J. F. . Media for isolation-cultivation-identification-maintenance of medical bacteria. 1, (1985).
- Bottone, E. J., Robin, T. Vibrio parahaemolyticus: suspicion of presence based on aberrant biochemical and morphological features. J. Clin. Microbiol. 8 (6), 760-763 (1978).
- Lotz, M. J., Tamplin, M. L., Rodrick, G. E. Thiosulfate-citrate-bile salts-sucrose agar and its selectivity for clinical and marine vibrio organisms. Ann. Clin. Lab. Sci. 13 (1), 45-48 (1983).
- Hara-Kudo, Y., Nishina, T., Nakagawa, H., Konuma, H., Hasegawa, J., Kumagai, S. Improved method for detection of Vibrio parahaemolyticus in seafood. Appl. Environ. Microbiol. 67 (12), 5819-5823 (2001).
- Eddabra, R., Piemont, Y., Scheftel, J. M. Evaluation of a new chromogenic medium, chromID Vibrio, for the isolation and presumptive identification of Vibrio choleare and Vibrio parahaemolyticus from human clinical specimens. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 30 (6), 733-737 (2011).
- Kodaka, H., Teramura, H., Mizuochi, S., Saito, M., Matsuoka, H. Evaluation of the Compact Dry VP method for screening raw seafood for total Vibrio parahaemolyticus. J. Food. Prot. 72 (1), 169-173 (2009).
- Su, Y. C., Duan, J., Wu, W. H. Selectivity and specificity of a chromogenic medium for detecting Vibrio parahaemolyticus. J. Food Prot. 68 (7), 1454-1456 (2005).
- Bej, A. K., Patterson, D. P., Brasher, C. W., Vickery, M. C., Jones, D. D., Kaysner, C. A. Detection of total and hemolysin-producing Vibrio parahaemolyticus in shellfish using multiplex PCR amplification of tl, tdh and trh. J. Microbiol. Methods. 36 (3), 215-225 (1999).
- Yeung, P. S. M., DePaola, A., Kaysner, C. A., Boor, K. J. A PCR assay for specific detection of the pandemic Vibrio parahaemolyticus O3:K6 clone from shellfish. J. Food Sci. 68 (4), 1459-1466 (2003).
- Yeung, P. S. M., Hayes, M. C., DePaola, A., Kaysner, C. A., Kornstein, L., Boor, K. J. Comparative phenotypic, molecular, and virulence characterization of Vibrio parahaemolyticus O3:K6 isolates. Appl. Environ. Microbiol. 68 (6), 2901-2909 (2002).
- Duan, J., Su, Y. -. C. Comparison of a chromogenic medium with thiosulfate-citrate-bile salts-sucrose agar for detecting Vibrio parahaemolyticus. J. Food Sci. 70, M125-M128 (2005).
- Pinto, A. D., Terio, V., Novello, L., Tantillo, G. Comparison between thiosulphate-citrate-bile salt sucrose (TCBS) agar and CHROMagar Vibrio for isolating Vibrio parahaemolyticus. Food Control. 22 (1), 124-127 (2011).
- Canizalez-Roman, A., Flores-Villaseñor, H., Zazueta-Beltran, J., Muro-Amador, S., Leòn-Sicairos, N. Comparative evaluation of a chromogenic agar medium-PCR protocol with a conventional method for isolation of Vibrio parahaemolyticus strains from environmental and clinical samples. Can J Microbiol. 57 (2), 136-142 (2011).
- Kriem, M. R., et al. Prevalence of Vibrio spp. in raw shrimps (Parapenaeus longirostris) and performance of a chromogenic medium for the isolation of Vibrio strains. Lett Appl Microbiol. 61 (3), 224-230 (2015).
- Food Drug Administration. Statistical guidance on reporting results from studies evaluating diagnostic tests. http://www.fda.gov/RegulatoryInformation/Guidances/ucm071148.htm. , (2007).
- Burd, E. M. Validation of laboratory-developed molecular assays for infectious diseases. Clin Microbiol Rev. 23 (3), 550-576 (2010).
