Развитие более чувствительным и специфичным хромогенного агаровой среде для обнаружения<em> Vibrio parahaemolyticus</em> И другие<em> Vibrio</em> Виды
Summary
Detection and isolation of clinically relevant Vibrio species require selective and differential culture media. This study evaluated the ability of a new chromogenic medium to detect and identify V. parahaemolyticus and other related species. The new medium was found to have better sensitivity and specificity than the conventional medium.
Abstract
Инфекций пищевого происхождения в США , вызванного вида Vibrio показали тенденцию к росту. В роду Vibrio, В. parahaemolyticus отвечает за большинство Vibrio -associated инфекций. Таким образом, четкое разграничение между Vibrio SPP. и обнаружение V. parahaemolyticus является критически важным для обеспечения безопасности наших продуктов питания. Хотя молекулярные методы являются более распространенными, культура, в зависимости от метода до сих пор обычно делается, и они считаются стандартными методами при определенных обстоятельствах. Следовательно, роман хромогенный агар был испытан с целью обеспечения лучшего способа выделения и дифференциации клинически значимых Vibrio SPP. Протокол по сравнению чувствительность, специфичность и предел обнаружения для обнаружения V. parahaemolyticus между новым хромогенного среды и обычной среды. Различные В. штаммы parahaemolyticus (п = 22) повторноиспользовались разнообразные представления серотипов и источник происхождения. Они ранее были идентифицированы с помощью пищевых продуктов и медикаментов (FDA) и Центры по контролю и профилактике заболеваний (CDC), и далее проверяется в нашей лаборатории TLH -PCR. По меньшей мере, четыре отдельных испытаний, эти штаммы высевали на чашках с хромогенных и тиосульфат-цитрат-солей желчных кислот с сахарозой (TCBS) агар, который является рекомендуемым среда для культивирования этого вида, с последующей инкубацией при 35-37 & deg; С в течение 24 -96 ч. Три В. parahaemolyticus штаммов (13,6%) не росли оптимально на TCBS, тем не менее , выставлены зеленые колонии , если был отмечен рост. Два штамма (9,1%) не дали ожидаемых голубых колоний на хромогенного агара. Non- В. parahaemolyticus штаммы (n = 32) были также испытаны для определения специфичности хромогенного агара. Среди этих штаммов, 31 не росли или выставлены другие колонии морфологию. Среднее восстановление V. parahaemolyticus на chromogeНИК агар ~ 96,4% по сравнению с трипсином соевом агаре с добавлением 2% NaCl. В заключение отметим , что новый хромогенный агар является эффективным средством для обнаружения V. parahaemolyticus и дифференцировать его от других вибрионов.
Introduction
В качестве члена рода Vibrio, V. parahaemolyticus является грам-отрицательных, не спорообразующих, изогнутые, палочковидные бактерии. Он демонстрирует высокую подвижность в жидких и полутвердых сред. Большинство V. штаммы parahaemolyticus не являются патогенными для человека, но патогенные подтипы вызвали эпидемии и пандемии, следовательно , этот вид считается важным патогеном пищевого происхождения во многих странах 1,2. Частота Vibrio инфекции в США показал тенденцию к росту с 2000 года 3. Среди Vibrio SPP., V. parahaemolyticus является наиболее часто сообщалось видов , вызывающих заболевания в США 4,5. Другие клинически значимые виды включают V. alginolyticus, В. vulnificus, В. вибрион и т.д. Небольшой процент болезней вызывается несколькими видами одновременно.
В. parahaemolyticus является естественным яnhabitant морской воды и, следовательно, широко распространены в морских водах по всему миру, включая эстуарии. Вид был открыт в 1950 году после вспышки пищевого отравления в Японии. В США этот вид был впервые выделен в морской воде, донных отложений, а также ракообразные в регионе Пьюджет – Саунд 6,7. Фильтраторов в морских средах обитания, таких как двустворчатые моллюски, могут питать В. parahaemolyticus как часть своей природной флоры 8. Как таковой, В. parahaemolyticus инфекции у человека часто связаны с потреблением загрязненных морепродуктов, особенно сырые или моллюска. Менее распространенный маршрут входа происходит, когда открытая рана подвергается воздействию морской воды, что приводит к инфекции кожи. Большинство V. штаммы parahaemolyticus не вызывают болезни человека, однако некоторые подтипы укрывательство факторы вирулентности , такие как термостабильной прямой гемолизина (TDH) являются патогенными. Наиболее распространенные симптомы пищевого происхождения V. parahaemolyticus инфекциейпонос и боли в животе, затем тошнота, рвота и лихорадка. Головная боль и озноб также сообщается. Средний инкубационный период составляет 15 ч, но может быть до 96 часов после потребления достаточного количества патогенных штаммов 9. Болезнь длится от двух до трех дней. Симптомы гастроэнтерита , вызванные V. parahaemolyticus в значительной степени самоограничения и поэтому специальная обработка не требуется. Легкие случаи гастроэнтерита можно эффективно лечить с помощью оральной регидратации. Более тяжелые болезни можно лечить с помощью антибиотиков , таких как тетрациклин или ципрофлоксацина 10. Смертность составляет около 2% за исключением случаев гастроэнтерита, но может достигать 29% для тех, кто разрабатывает инфекции кровотока или сепсис. Любой человек , который потребляет морепродукты или имеет открытую рану воздействию морской воды находится под угрозой V. parahaemolyticus инфекция. Чем более тяжелая форма болезни, угрожающей жизни сепсиса, чаще встречается у субпопуляции с основного медицинского сотрудничестваnditions 11, которые включают в себя алкоголизм, заболевания печени, сахарный диабет, заболевания почек, злокачественные опухоли, а также другие условия , приводящие к ослаблению иммунного ответа. Примечательно, что эта группа лиц также подвергаются более высокому риску заражения для тяжелых заболеваний , вызванных V. vulnificus, которые могут быть найдены в естественной среде обитания , похожими на V. parahaemolyticus.
В. parahaemolyticus регулярно выделяли с использованием тиосульфата-цитрата солей желчных кислот с сахарозой (TCBS) агар в качестве селективного и дифференциальной среды. Обогащение в щелочной пептонной воде может предшествовать изоляции на TCBS агар. ФИКСИРОВАННЫЕ колонии на TCBS затем дополнительно протестированы в массиве биохимических тестов и / или молекулярных анализов, ориентированных на присутствие генов видоспецифичных. Основанные на ПЦР методы часто используются для подтверждения личности V. parahaemolyticus путем амплификации гена термолабильный гемолизина, TLH 12.
Независимо от того, чOICE методов подтверждения, важно иметь эффективную среду для выделения и дифференцироваться В. parahaemolyticus от других морских вибрионов в первую очередь. TCBS обычно была использована для дифференциации видов в пределах рода Vibrio в соответствии со своими способностями к ферментируют сахарозу 12. Положительная реакция брожения сопровождается изменением цвета индикатора рН Бромтимоловый синего. V. parahaemolyticus колонии довольно отличительные от TCBS, показывая синего до зеленого цвета. Тем не менее, эта среда не может легко отличить В. alginolyticus и В. вибрион. Сахароза сбраживающие видов Proteus может производить желтые колонии , напоминающие В. вибрион или V. alginolyticus 13. На первоначальном выделении на TCBS, V. parahaemolyticus также может быть ошибочно , как Aeromonas hydrophila, Plesiomonas shigelloides и Pseudomonas SPP 14. Штаммы с задержкой FERM сахарозыентация могут быть спутаны с другими сахарозы неферментирующие Vibrio 13, которые включают в себя В. parahaemolyticus. TCBS оказался не чувствителен к кишечной палочки, Pseudomonas putrefaciens, среди других. Несколько других видов дают зеленого до серых колоний , которые потенциально путают с V. parahaemolyticus или V. vulnificus 15. В результате, желательно разработать альтернативный культуральных сред с лучшей чувствительностью и специфичностью по отношению к обнаружению и изоляции V. parahaemolyticus и других близких видов.
Несколько альтернативных СМИ были недавно разработаны. В дополнение к включению селективных агентов, наиболее включать хромогенных субстратов для дифференциации видов на основе их дифференциальных ферментной активности. Например, индоксил-β-глюкозид и индоксил-β-галактозид, использовались в качестве хромогенных субстратов для дифференциации V. пунктhaemolyticus колонии (которые появляются голубовато-зеленые) от тех , V. вибрион (фиолетовый) из – за их различной способностью производить бета-глюкозидазы и бета-галактозидазы 16. Различные составы хромогенного агара , разработанные несколько групп были оценены и были сообщены для выполнения сравнительно или лучше , чем TCBS 17,18,19. Преимущество использования хромогенного среды является то, что окраска окружающей среды минимальна, таким образом, облегчая выделение отдельных колоний. В данном исследовании мы оценивали способность вновь сформулированной хромогенного среды для обнаружения и изолирования V. вибрион, В. parahaemolyticus и В. vulnificus; с особым акцентом на его способности различать В. parahaemolyticus от других видов.
Protocol
Representative Results
Discussion
В данном исследовании основное внимание уделяется разработке и оценке культуры средств массовой информации. Обычно TCBS является селективное и дифференциальная среда , используемая для выделения и обнаружения V. parahaemolyticus, В. вибрион и В. vulnificus 12. Тем не менее, ограничения ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим М. Channey, Э. Чау, К. Томас за их помощь по проекту. Поставленный по проекту были частично финансировалась Политехнический университет штата Калифорния.
Materials
| Reagent/Equipment | |||
| Agar | Fisher Scientific | DF0140-15-4 | may use other brands |
| Autoclave | Any | ||
| BHI powder | Fisher Scientific | DF0418-17-7 | may use other brands |
| Blender | Any | to blend oyster meat | |
| CampyGen gas generator | Hardy Diagnostics | CN035A | to provide a microaerophilic atmosphere; may use other brands |
| Chocolate agar plates | Hardy Diagnostics | E14 | may use other brands |
| Common PCR reagents (dNTPs, MgCl2, Taq Polymerase) | Any | or use PCR beads (Fisher Sci 46-001-014) | |
| Culture tubes | Fisher Scientific | S50712 | may use other brands |
| Eppendorf tubes | Fisher Scientific | S348903 | may use other brands |
| Gel doc | Any | ||
| HardyChrom Vibrio agar plates | Hardy Diagnostics | G319 | This study evaluates this medium |
| Incubator | Any | ||
| Inoculating loops | Fisher Scientific | 22-363-606 | 10 microliter-size was used in this study |
| NaCl | Fisher Scientific | BP358-212 | may use other brands |
| Oysters | Any | ||
| PBS | Fisher Scientific | R23701 | may use other brands |
| Petri dish | Fisher Scientific | FB0875713 | may use other brands |
| Pipette and tips | Any | Sterilized tips | |
| Primers for tlh | IDT DNA | ||
| Scale | Any | ||
| Spreader | Fisher Scientific | 08-100-11 | Beads may be used instead |
| Stomacher blender | Stomacher | 400 | Samples were homogenized at 200 rpm for 30 sec. Other homogenizer can be used. |
| Sterile filter bags for blenders | Fisher Scientific | 01-812-5 | |
| TCBS powder | Hardy Diagnostics | 265020 | This study evaluates this medium |
| Thermocycler | Any | ||
| TSB powder | Fisher Scientific | DF0370-07-5 | may use other brands |
| UV viewing cabinet | Any | Emit long-wave UV light | |
| Water bath | Any | ||
| Name | Sources | Catalog Number | Comments |
| Bacterial species and strains | |||
| Aeromonas hydrophila | ATCC | ||
| Candida albicans | ATCC | ||
| Campylobacter jejuni | ATCC | ||
| Escherichia coli | ATCC | ||
| Proteus mirabilis | ATCC | ||
| Pseudomonas aeruginosa | ATCC | ||
| Staphylococcus aureus | ATCC | ||
| Salmonella Choleraesuis | ATCC | ||
| Shigella boydii | ATCC | ||
| Shigella flexneri | ATCC | ||
| Shigella sonnei | ATCC | ||
| Vibrio alginolyticus | ATCC | ||
| V. cholerae (serotypes include O139, O1, non O1, El Tor biovars) | FDA, ATCC | ||
| V. damsela | FDA | ||
| V. fisherii | Environment | ||
| V. fluvialis | CDC | ||
| V. furnissii | CDC | ||
| V. hollisae | FDA | ||
| V. metschnikovii | ATCC | ||
| V. mimicus | FDA | ||
| V. parahaemolyticus(serotypes include O3:K6, O1:K56, O4:K8, O5:K15, O8, etc) | ATCC, FDA, CDC, Environment | ||
| V. proteolyticus | FDA | ||
| V. vulnificus | FDA |
References
- Yeung, P. S., Boor, K. J. Epidemiology, pathogenesis, and prevention of foodborne Vibrio parahaemolyticus infections. Foodborne Pathog. Dis. 1 (2), 74-88 (2004).
- Yeung, P. S. M., Boor, K. J., Faruque, S. M. Epidemiology, molecular biology, and detection of foodborne Vibrio parahaemolyticus infections. Foodborne and Waterborne Bacterial pathogens: Epidemiology, Evolution and Molecular Biology. , 153-184 (2012).
- Centers for Disease Control and Prevention. Vital Signs: Incidence and Trends of Infection with Pathogens Transmitted Commonly Through Food – Foodborne Diseases Active Surveillance Network, 10 U.S. Sites, 1996-2010. Morbidity and Mortality Weekly Report. 10, 1996-2010 (2011).
- . Summary of human Vibrio cases reported to CDC, 2008 Available from: https://stacks.cdc.gov/view/cdc/21591 (2008)
- Scallan, E., et al. Foodborne illness acquired in the United States – major pathogens. Emerg. Infect. Dis. 17 (1), 7-15 (2011).
- Baross, J., Liston, J. Occurrence of Vibrio parahaemolyticus and related hemolytic vibrios in marine environments of Washington State. Appl. Microbiol. 20 (2), 179-186 (1970).
- Baross, J., Liston, J. Isolation of Vibrio parahaemolyticus from the Northwest Pacific. Nature. 217 (5135), 1263-1264 (1968).
- Kueh, C. S., Chan, K. Y. Bacteria in bivalve shellfish with special reference to the oyster. J. Appl. Bacteriol. 59 (1), 41-47 (1985).
- Food and Drug Administration. . Bad Bug Book, Foodborne Pathogenic Microorganisms and Natural Toxins. , (2012).
- Qadri, F., et al. Adaptive and inflammatory immune responses in patients infected with strains of Vibrio parahaemolyticus. J. Infect. Dis. 187 (7), 1085-1096 (2003).
- MacFaddin, J. F. . Media for isolation-cultivation-identification-maintenance of medical bacteria. 1, (1985).
- Bottone, E. J., Robin, T. Vibrio parahaemolyticus: suspicion of presence based on aberrant biochemical and morphological features. J. Clin. Microbiol. 8 (6), 760-763 (1978).
- Lotz, M. J., Tamplin, M. L., Rodrick, G. E. Thiosulfate-citrate-bile salts-sucrose agar and its selectivity for clinical and marine vibrio organisms. Ann. Clin. Lab. Sci. 13 (1), 45-48 (1983).
- Hara-Kudo, Y., Nishina, T., Nakagawa, H., Konuma, H., Hasegawa, J., Kumagai, S. Improved method for detection of Vibrio parahaemolyticus in seafood. Appl. Environ. Microbiol. 67 (12), 5819-5823 (2001).
- Eddabra, R., Piemont, Y., Scheftel, J. M. Evaluation of a new chromogenic medium, chromID Vibrio, for the isolation and presumptive identification of Vibrio choleare and Vibrio parahaemolyticus from human clinical specimens. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 30 (6), 733-737 (2011).
- Kodaka, H., Teramura, H., Mizuochi, S., Saito, M., Matsuoka, H. Evaluation of the Compact Dry VP method for screening raw seafood for total Vibrio parahaemolyticus. J. Food. Prot. 72 (1), 169-173 (2009).
- Su, Y. C., Duan, J., Wu, W. H. Selectivity and specificity of a chromogenic medium for detecting Vibrio parahaemolyticus. J. Food Prot. 68 (7), 1454-1456 (2005).
- Bej, A. K., Patterson, D. P., Brasher, C. W., Vickery, M. C., Jones, D. D., Kaysner, C. A. Detection of total and hemolysin-producing Vibrio parahaemolyticus in shellfish using multiplex PCR amplification of tl, tdh and trh. J. Microbiol. Methods. 36 (3), 215-225 (1999).
- Yeung, P. S. M., DePaola, A., Kaysner, C. A., Boor, K. J. A PCR assay for specific detection of the pandemic Vibrio parahaemolyticus O3:K6 clone from shellfish. J. Food Sci. 68 (4), 1459-1466 (2003).
- Yeung, P. S. M., Hayes, M. C., DePaola, A., Kaysner, C. A., Kornstein, L., Boor, K. J. Comparative phenotypic, molecular, and virulence characterization of Vibrio parahaemolyticus O3:K6 isolates. Appl. Environ. Microbiol. 68 (6), 2901-2909 (2002).
- Duan, J., Su, Y. -. C. Comparison of a chromogenic medium with thiosulfate-citrate-bile salts-sucrose agar for detecting Vibrio parahaemolyticus. J. Food Sci. 70, M125-M128 (2005).
- Pinto, A. D., Terio, V., Novello, L., Tantillo, G. Comparison between thiosulphate-citrate-bile salt sucrose (TCBS) agar and CHROMagar Vibrio for isolating Vibrio parahaemolyticus. Food Control. 22 (1), 124-127 (2011).
- Canizalez-Roman, A., Flores-Villaseñor, H., Zazueta-Beltran, J., Muro-Amador, S., Leòn-Sicairos, N. Comparative evaluation of a chromogenic agar medium-PCR protocol with a conventional method for isolation of Vibrio parahaemolyticus strains from environmental and clinical samples. Can J Microbiol. 57 (2), 136-142 (2011).
- Kriem, M. R., et al. Prevalence of Vibrio spp. in raw shrimps (Parapenaeus longirostris) and performance of a chromogenic medium for the isolation of Vibrio strains. Lett Appl Microbiol. 61 (3), 224-230 (2015).
- Food Drug Administration. Statistical guidance on reporting results from studies evaluating diagnostic tests. http://www.fda.gov/RegulatoryInformation/Guidances/ucm071148.htm. , (2007).
- Burd, E. M. Validation of laboratory-developed molecular assays for infectious diseases. Clin Microbiol Rev. 23 (3), 550-576 (2010).
