JoVE Journal > Genetics
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Türkçe

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Genetics

Rapid Metodoloji tarafından Roman RNA Bağlayıcı Proteinler İzolasyon

Published: September 30, 2016
doi:
10.3791/54467
,
1Faculty of Biology,Technion – Israel Institute of Technology, 2Department of Biomolecular Sciences,Weizmann Institute of Science

Summary

RNA-protein interactions lie at the heart of many cellular processes. Here, we describe an in vivo method to isolate specific RNA and identify novel proteins that are associated with it. This could shed new light on how RNAs are regulated in the cell.

Abstract

RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern biology. Only a few in vitro and in vivo methods enable the identification of RBPs associated with a particular target mRNA. However, their main limitations are the identification of RBPs in a non-cellular environment (in vitro) or the low efficiency isolation of RNA of interest (in vivo). An RNA-binding protein purification and identification (RaPID) methodology was designed to overcome these limitations in yeast and enable efficient isolation of proteins that are associated in vivo. To achieve this, the RNA of interest is tagged with MS2 loops, and co-expressed with a fusion protein of an MS2-binding protein and a streptavidin-binding protein (SBP). Cells are then subjected to crosslinking and lysed, and complexes are isolated through streptavidin beads. The proteins that co-purify with the tagged RNA can then be determined by mass spectrometry. We recently used this protocol to identify novel proteins associated with the ER-associated PMP1 mRNA. Here, we provide a detailed protocol of RaPID, and discuss some of its limitations and advantages.

Introduction

RNA bağlayıcı proteinler (RBPS) S. yaklaşık% 10'unu temsil cerevisiae proteinleri 1,2 ve memeli proteinlerinin 3-5 arasında yaklaşık% 15. Bunlar mRNA transkripsiyon sonrası işleme ve düzenleme, çeviri, ribozom biogenezinin, tRNA Aminoacylation ve modifikasyon, kromatin yeniden ve daha fazlası gibi birçok hücresel süreçlere de karışırlar. RBPS önemli bir alt grubu, mRNA bağlayıcı proteinler (mRNPs) 6,7 olan. MRNA olgunlaşma sürecinde, farklı RBPS transkript bağlamak ve nükleus, hücresel lokalizasyonu, çeviri ve bozulma 6-8 dışarı nükleer işleme, ihracat aracılık eder. Böylece, herhangi bir zaman noktasında belirli bir transkript bağlı RBPS ayrı set onun işleme ve sonuçta onun kaderi belirler.

Bir mRNA ile ilişkili RBPS belirlenmesi önemli ölçüde transkripsiyon sonrası düzenleme altında yatan süreçlerin anlayışımızı artırabilir. genetik çeşitlilikMikroskobik, biyokimyasal ve biyoinformatik yöntemleri (9-11 gözden) mRNA düzenlenmesinde rol proteinleri tespit etmek için kullanılmıştır. Bununla birlikte, bu yöntem sadece birkaç özel bir hedef mRNA ile ilişkili proteinlerin belirlenmesini mümkün kılmaktadır. Dikkat çekici bir şekilde, maya hücreleri bir ekspresyon kolleksiyonunu taramak için yem olarak ilgili mRNA'nın kullanır maya üç hibrid sistemi (Y3H) 'dir. Pozitif klonlar genellikle büyüme seçimi ya da muhabir ifade 12-14 ile gözlenir. Bu yöntemin en önemli avantajı, hücre ortamında ve RNA-protein etkileşiminin gücünü ölçmek için yeteneği taranabilir proteinlerin büyük bir sayıdır. Dezavantajları nedeniyle spesifik olmayan yanlış pozitif sonuç, görece olarak yüksek ve füzyon proteini, av veya yem RNA yanlış katlanma kısmen hatalı negatif sonuçlar, yüksek bir potansiyel bulunmaktadır.

Genetik yaklaşım alternatif afinite purifi olanilişkili proteinler RNA katyonudur. Poli A ihtiva eden mRNA oligo dT sütun kullanılarak izole edilebilir, ve bunların ilişkili proteinler kütle spektrometrisi ile tespit edilir. RNA-protein etkileşimi, kısa menzilli kovalent bağlar yapan çapraz bağlama suretiyle, hücresel bir çerçevede, muhafaza edilir. Oligo dT sütunun kullanılması mRNA 3,5,15 A-içeren herhangi bir poli ile ilişkili tüm proteom küresel bir görünüm verir. Bununla birlikte, belirli bir mRNA ile ilişkili proteinlerin bir listesi sağlamaz. Çok az metotlar, bir kimlik gerçekleştirmek için kullanılabilir. ÇİFT yöntemi hedefe mRNA 16,17 ile tamamlayıcılık ile nükleik asidin transfeksiyon gerektirir. nükleik asit, aynı zamanda etkileşim bölgesi yakın çevresinde RBPS için çapraz bağlama sağlayan bir peptit eklenir. çapraz bağlama sonrasında RBP-peptid-nükleik asit izole edilebilir ve proteomik analizine tabi tutulmuştur. Son zamanlarda, bir aptamer tabanlı metodoloji oldubaşarılı bir şekilde, memeli hücre hatları 18 alıntılar uygulanır. streptavidin geliştirilmiş afiniteye sahip bir RNA aptamer geliştirilmiş ve (bu durumda AU zengin elemanı (ARE)) ilgi konusu bir sekansına kaynaştırılır. Aptamer RNA streptavidin boncuk bağlanmış ve hücre lizatı ile karıştırıldı. Sırasına ilişkili proteinler arıtıldı ve kütle spektrometrisi (MS) ile tespit edilmiştir. Bu yöntem hücresel ayarları (örneğin, in vitro) dışında meydana dernekler bulgulamışsak da, mRNA ile ilişkili proteinlerin izolasyonu genomuna aptamers vermek ve bu şekilde mümkün kılacak şekilde, gelecekte değişecektir olduğu süre hücresel ortam (yani, in vivo). Genetik manipülasyonlar iyi kurulmuş maya, olarak, (Prof. Dr. Jeff Gerst laboratuarında geliştirilen) hızlı yöntem, in vivo dernekler 19 bir görünüm sağlar. Rapid (özel ve MS2 kat proteinin bağlanma güçlü MS2- birleştirirVe) streptavidin bağlama alanı (SBP MS2 RNA dizisine CP) konjuge boncuk streptavidin. Bu streptavidin boncuk ile MS2 etiketli mRNA'ların etkili arınma sağlar. Ayrıca, MS2 döngüler 12 kopya sentezleme RNA eş zamanlı olarak bağlanan ve izolasyon verimini geliştirmek için, altı MS2-CP izin verir. Bu protokol, bu nedenle elüt örnekler kütle spektrometrisi ile proteomik analizine tabi kez yeni mRNA ilişkili proteinlerin belirlenmesini sağlamak için önerilmiştir.

Son zamanlarda, maya PMP1 mRNA 20 ile bağlantılı yeni proteinleri belirlemek için hızlı kullanmıştır. PMP1 mRNA daha önce ER membran ile ilişkili olduğu ve 3 'çevrilmemiş bölgesi (UTR) Bu ilişki 21 önemli bir belirleyici olduğu bulunmuştur gördü. Bu nedenle, PMP1 3 'UTR bağlanan RBPS lokalizasyonu önemli bir rol oynaması olasıdır. HIZLI sıvı kromatografı ve ardındany-kütle spektrometrisi / kütle spektrometrisi (LC-MS / MS) PMP1 20 ile etkileşim çok sayıda yeni protein da tespit ettik. Bu yazıda, Rapid metodoloji ayrıntılı bir protokol sağlar, gerek önemli kontroller yapılır ve verim ve özgüllüğünü artırabilir teknik ipuçları edilecek.

Protocol

Not: 12 MS2 bağlayıcı siteleri kapsayan bir dizi takın (MS2 döngüler; MS2L) istenen genomik içine, genellikle, açık okuma çerçevesinin (ORF) 3 'UTR arasındadır. Bu entegrasyon için ayrıntılı bir protokol yerde 22 sağlanır. PCR, kuzey analizi veya RT-PCR 20,23 tarafından uygun ekleme ve ifade doğrulayın. Entegrasyon 3'UTR'sinden sentezi ile müdahale etmedi doğrulamak için önemlidir. Buna ek olarak, indüklenebilir bir promotör (metiyonin tükenmesi) ekspresyonu…

Representative Results

Rapid ilişkili proteinler ile spesifik bir hedef RNA'nın izolasyonu sağlar. başarısı için kritik böylece proteinin yeterli miktarda elde edilmesi mümkün olduğu kadar sağlam RNA tutmak. RNA izolasyonu etkinliğini ve kalitesini saptamak için northern analizi (Şekil 1A) gerçekleştirilir. Kuzey analizi doğrudan Rapid verimliliğini ve kalitesini raporlama avantajına sahiptir. Bu nedenle, tam uzunluktaki ve bozunma ürünlerinin nispi miktarları tek bi…

Discussion

Çeşitli yöntemler ilişkili proteinleri 11,34 35 tanımlamak için belirli bir mRNA izolasyonunu kullanımı. Bu yöntemler, bir RNA-protein etkileşimlerini incelemek için in vitro ve in vivo stratejileri geçerlidir. In vitro yöntemler, dışsal RBPS yakalamak ve RNP kompleksleri 36,37 izole etmek için hücre lizatı ile RNA transkripsiyonu inkübe edin. Bu tip bir etkili bir yaklaşım, bir düzenleyici RNA motifi 18 bağlanan yeni …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Biz hızlı protokol kurma ve gerekli plazmitleri sağlayarak onların yararlı tavsiyeler Prof. Jeff Gerst ve Boris Slobodin teşekkür ederiz. Biz de LC-MS / MS analizi ile ona yardım için Smoler Proteomiks Merkezi'nden bu protokolü Dr. Tamar Ziv kurulması ona yardım için Dr. Avigail Atir-Lande teşekkür ederim. Biz YEF3 antikor Prof. TG Kinzy (Rutgers) teşekkür ederim. Bu çalışma Binational Bilim Vakfı hibe 2011013 tarafından desteklenmiştir.

Materials

Tris sigma T1503
SDS bio-lab 1981232300
DTT sigma D9779
Acidic Phenol (pH 4.3) sigma P4682
Acidic Phenol: Chloroform (5:1, pH 4.3) sigma P1944
Chloroform bio-lab 3080521
Formaldehyde Frutarom 5551820
Glycine sigma G7126
NP-40 Calbiochem 492016
Heparin Sigma H3393
Phenylmethylsulfonyl Flouride (PMSF) Sigma P7626
Leupeptin Sigma L2884
Aprotinin Sigma A1153
Soybean Trypsin Inhibitor Sigma T9003
Pepstatin Sigma P5318
DNase I Promega M610A
Ribonuclease  Inhibitor Takara 2313A
Glass Beads Sartorius BBI-8541701 0.4-0.6mm diameter 
Mini BeadBeater BioSpec Mini BeadBeater 16
Guanidinium Sigma G4505
Avidin Sigma A9275
Streptavidin Beads GE Healthcare  17-5113-01
Bovine serum albumin (BSA) Sigma A7906
Yeast tRNA Sigma R8508
Biotin Sigma B4501
Yeast extract Bacto 288620
peptone Bacto 211677
Glucose Sigma G8270
1 x Phosphate-Buffered saline (PBS)
0.2 M NaOH
4 x Laemmli Sample Buffer (LSB) 0.2 M Tris-Hcl pH 6.8, 8% SDS, 0.4 M DTT, 40% glycerol, 0.04% Bromophenol-Blue.
Hot phenol lysis buffer 10 mM Tris pH 7.5, 10 mM EDTA, 0.5% SDS 
3 M Sodium Acetate pH 5.2
100% and 70% Ethanol (EtOH)
RNase-free water
RaPID lysis buffer 20 mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCl, 1.8 mM MgCl2, 0.5% NP-40, 5 mg/ml Heparin, 1 mM Dithiothreitol (DTT), 1 mM Phenylmethylsulfonyl Flouride (PMSF), 10 µg/ml Leupeptin, 10 µg/ml Aprotinin, 10 µg/ml Soybean Trypsin Inhibitor, 10 µg/ml Pepstatin, 20 U/ml DNase I, 100 U/ml Ribonuclease  Inhibitor.
2x Cross-linking reversal buffer 100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA, 20 mM DTT, 2 % SDS.
RaPID wash buffer 20 mM Tris-HCl pH 7.5,  300 mM NaCl, 0.5% NP-40
0.5 M EDTA pH 8
Silver Stain Plus Kit Bio-Rad  161-0449 For detecting proteins in polyacrylamide gels
SD selective medium  1.7 g/l Yeast nitrogen base with out amino acids and ammonium sulfate, 5 g/l Ammonium sulfate, 2% glucose, 350 mg/l Threonine, 40 mg/l Methionine, 40 mg/l Adenine, 50 mg/l Lysine, 50 mg/l Tryptophan, 20 mg/l Histidine, 80 mg/l Leucine, 30 mg/l Tyrosine, 40 mg/l Arginine
Anti-eEF3 (EF3A,YEF3) Gift from Kinzy TG. (UMDNJ Robert Wood Johnson Medical School) 1:5,000
Anti GFP antibody Santa Cruz sc-8334 1:3,000
Anti rabbit IgG-HRP conjugated SIGMA A9169 1:10,000
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hogan, D. J., Riordan, D. P., Gerber, A. P., Herschlag, D., Brown, P. O. Diverse RNA-binding proteins interact with functionally related sets of RNAs, suggesting an extensive regulatory system. PLoS Biol. 6, e255 (2008).
  2. Tsvetanova, N. G., Klass, D. M., Salzman, J., Brown, P. O. Proteome-wide search reveals unexpected RNA-binding proteins in Saccharomyces cerevisiae. PloS One. 5, (2010).
  3. Castello, A., et al. Insights into RNA biology from an atlas of mammalian mRNA-binding proteins. Cell. 149, 1393-1406 (2012).
  4. Gerstberger, S., Hafner, M., Tuschl, T. A census of human RNA-binding proteins. Nat Rev Genet. 15, 829-845 (2014).
  5. Baltz, A. G., et al. The mRNA-bound proteome and its global occupancy profile on protein-coding transcripts. Mol Cell. 46, 674-690 (2012).
  6. Mitchell, S. F., Parker, R. Principles and properties of eukaryotic mRNPs. Mol Cell. 54, 547-558 (2014).
  7. Licatalosi, D. D., Darnell, R. B. RNA processing and its regulation: global insights into biological networks. Nat Rev Genet. 11, 75-87 (2010).
  8. Eliyahu, E., Lesnik, C., Arava, Y. The protein chaperone Ssa1 affects mRNA localization to the mitochondria. FEBS Lett. 586, 64-69 (2012).
  9. Ascano, M., Gerstberger, S., Tuschl, T. Multi-disciplinary methods to define RNA-protein interactions and regulatory networks. Curr Opin Genet Dev. 23, 20-28 (2013).
  10. Denman, R. B. mRNPs take shape by CLIPPING and PAIRING. BioEssays. 28, 1132-1143 (2006).
  11. McHugh, C. A., Russell, P., Guttman, M. Methods for comprehensive experimental identification of RNA-protein interactions. Genome Biol. 15, 203 (2014).
  12. Bernstein, D. S., Buter, N., Stumpf, C., Wickens, M. Analyzing mRNA-protein complexes using a yeast three-hybrid system. Methods. 26, 123-141 (2002).
  13. SenGupta, D. J., et al. A three-hybrid system to detect RNA-protein interactions in vivo. Proc Natl Acad Sci USA. 93, 8496-8501 (1996).
  14. Yosefzon, Y., et al. Divergent RNA binding specificity of yeast Puf2p. RNA. 17, 1479-1488 (2011).
  15. Mitchell, S. F., Jain, S., She, M., Parker, R. Global analysis of yeast mRNPs. Nat Struct Mol Biol. 20, 127-133 (2013).
  16. Zielinski, J., et al. In vivo identification of ribonucleoprotein-RNA interactions. Proc Natl Acad Sci USA. 103, 1557-1562 (2006).
  17. Bell, T. J., Eberwine, J. Live Cell Genomics: RNA Exon-Specific RNA-Binding Protein Isolation. Methods Mol Biol. 1324, 457-468 (2015).
  18. Leppek, K., Stoecklin, G. An optimized streptavidin-binding RNA aptamer for purification of ribonucleoprotein complexes identifies novel ARE-binding proteins. Nucleic Acids Res. 42, e13 (2014).
  19. Slobodin, B., Gerst, J. E. A novel mRNA affinity purification technique for the identification of interacting proteins and transcripts in ribonucleoprotein complexes. RNA. 16, 2277-2290 (2010).
  20. Samra, N., Atir-Lande, A., Pnueli, L., Arava, Y. The elongation factor eEF3 (Yef3) interacts with mRNA in a translation independent manner. BMC Mol Biol. 16, 17 (2015).
  21. Loya, A., et al. The 3′-UTR mediates the cellular localization of an mRNA encoding a short plasma membrane protein. RNA. 14, 1352-1365 (2008).
  22. Haim-Vilmovsky, L., Gadir, N., Herbst, R. H., Gerst, J. E. A genomic integration method for the simultaneous visualization of endogenous mRNAs and their translation products in living yeast. RNA. 17, 2249-2255 (2011).
  23. Eldad, N., Yosefzon, Y., Arava, Y. Identification and characterization of extensive intra-molecular associations between 3′-UTRs and their ORFs. Nucleic Acids Res. 36, 6728-6738 (2008).
  24. Slobodin, B., Gerst, J. E. RaPID: an aptamer-based mRNA affinity purification technique for the identification of RNA and protein factors present in ribonucleoprotein complexes. Methods Mol Biol. 714, 387-406 (2011).
  25. Schmitt, M. E., Brown, T. A., Trumpower, B. L. A rapid and simple method for preparation of RNA from Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Res. 18, 3091-3092 (1990).
  26. Eldad, N., Arava, Y. A ribosomal density-mapping procedure to explore ribosome positions along translating mRNAs. Methods Mol Biol. 419, 231-242 (2008).
  27. Arava, Y., Seger, R., Fbeta Walker, M. D. GRFbeta, a novel regulator of calcium signaling, is expressed in pancreatic beta cells and brain. J Biol Chem. 274, 24449-24452 (1999).
  28. Arava, Y., Adamsky, K., Ezerzer, C., Ablamunits, V., Walker, M. D. Specific gene expression in pancreatic beta-cells: cloning and characterization of differentially expressed genes. Diabetes. 48, 552-556 (1999).
  29. Bavli-Kertselli, I., Melamed, D., Bar-Ziv, L., Volf, H., Arava, Y. Overexpression of eukaryotic initiation factor 5 rescues the translational defect of tpk1w in a manner that necessitates a novel phosphorylation site. FEBS J. 282, 504-520 (2015).
  30. Eliyahu, E., Melamed, D., Arava, Y. Genome-wide analysis of RNA extracted from isolated mitochondria. Methods Mol Biol. 714, 287-299 (2011).
  31. Brunelle, J. L., Green, R. One-dimensional SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (1D SDS-PAGE). Methods Enzymol. 541, 151-159 (2014).
  32. Gundry, R. L., et al. Preparation of proteins and peptides for mass spectrometry analysis in a bottom-up proteomics workflow. Current protocols in molecular biology. Chapter 10, Unit 10.25 (2009).
  33. Medzihradszky, K. F. In-solution digestion of proteins for mass spectrometry. Methods Enzymol. 405, 50-65 (2005).
  34. Bachler, M., Schroeder, R., von Ahsen, U. StreptoTag: a novel method for the isolation of RNA-binding proteins. RNA. 5, 1509-1516 (1999).
  35. Oeffinger, M. Two steps forward–one step back: advances in affinity purification mass spectrometry of macromolecular complexes. Proteomics. 12, 1591-1608 (2012).
  36. Ross, A. F., Oleynikov, Y., Kislauskis, E. H., Taneja, K. L., Singer, R. H. Characterization of a beta-actin mRNA zipcode-binding protein. Mol Cell Biol. 17, 2158-2165 (1997).
  37. Deshler, J. O., Highett, M. I., Schnapp, B. J. Localization of Xenopus Vg1 mRNA by Vera protein and the endoplasmic reticulum. Science. 276, 1128-1131 (1997).
  38. Bertrand, E., et al. Localization of ASH1 mRNA particles in living yeast. Mol Cell. 2, 437-445 (1998).
  39. Aizer, A., et al. Quantifying mRNA targeting to P-bodies in living human cells reveals their dual role in mRNA decay and storage. J Cell Sci. 127, 4443-4456 (2014).
  40. Gadir, N., Haim-Vilmovsky, L., Kraut-Cohen, J., Gerst, J. E. Localization of mRNAs coding for mitochondrial proteins in the yeast Saccharomyces cerevisiae. RNA. 17, 1551-1565 (2011).
  41. Lopez de Heredia, ., M, R. P., Jansen, RNA integrity as a quality indicator during the first steps of RNP purifications : a comparison of yeast lysis methods. BMC Biochem. 5, 14 (2004).
  42. Lee, J. S., Kallehauge, T. B., Pedersen, L. E., Kildegaard, H. F. Site-specific integration in CHO cells mediated by CRISPR/Cas9 and homology-directed DNA repair pathway. Sci Rep. 5, 8572 (2015).
  43. Auer, T. O., Duroure, K., De Cian, A., Concordet, J. P., Del Bene, F. Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated knock-in in zebrafish by homology-independent DNA repair. Genome Res. 24, 142-153 (2014).
  44. Oda, Y., Huang, K., Cross, F. R., Cowburn, D., Chait, B. T. Accurate quantitation of protein expression and site-specific phosphorylation. Proc Natl Acad Sci USA. 96, 6591-6596 (1999).
  45. de Godoy, L. M. SILAC yeast: from labeling to comprehensive proteome quantification. Methods Mol Biol. 1156, 81-109 (2014).

Tags

RNA-binding ProteinsRaPID MethodologyRNA MetabolismRNA RegulationMRNA-associated ProteinsMS2-tagged MRNAMS2 Binding ProteinStreptavidin Binding ProteinCross-linkingRapid PurificationRNA DegradationRapid Lysis BufferBead-beatingCell Lysate

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Samra, N., Arava, Y. Novel RNA-Binding Proteins Isolation by the RaPID Methodology. J. Vis. Exp. (115), e54467, doi:10.3791/54467 (2016).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image