RNA מחייב רומן בידוד חלבונים לפי שיטת RAPID
Summary
RNA-protein interactions lie at the heart of many cellular processes. Here, we describe an in vivo method to isolate specific RNA and identify novel proteins that are associated with it. This could shed new light on how RNAs are regulated in the cell.
Abstract
RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern biology. Only a few in vitro and in vivo methods enable the identification of RBPs associated with a particular target mRNA. However, their main limitations are the identification of RBPs in a non-cellular environment (in vitro) or the low efficiency isolation of RNA of interest (in vivo). An RNA-binding protein purification and identification (RaPID) methodology was designed to overcome these limitations in yeast and enable efficient isolation of proteins that are associated in vivo. To achieve this, the RNA of interest is tagged with MS2 loops, and co-expressed with a fusion protein of an MS2-binding protein and a streptavidin-binding protein (SBP). Cells are then subjected to crosslinking and lysed, and complexes are isolated through streptavidin beads. The proteins that co-purify with the tagged RNA can then be determined by mass spectrometry. We recently used this protocol to identify novel proteins associated with the ER-associated PMP1 mRNA. Here, we provide a detailed protocol of RaPID, and discuss some of its limitations and advantages.
Introduction
חלבונים קושרי RNA (RBPs) מייצגים כ -10% של ס חלבוני cerevisiae 1,2 וכ -15% של חלבונים יונקים 3-5. הם מעורבים תהליכים תאיים רבים כגון mRNA שלאחר תעתיק עיבוד ורגולציה, תרגום, biogenesis הריבוזום, tRNA aminoacylation ושינוי, שיפוץ הכרומטין, ועוד. בפלח חשוב של RBPs הוא חלבונים קושרי mRNA (mRNPs) 6,7. במהלך ההבשלה mRNA, RBPs שונים לקשור את התמליל ואת לתווך עיבוד הגרעין שלה, לייצא מתוך הגרעין, לוקליזציה הסלולר, תרגום והשפלה 6-8. לפיכך, הקבוצה הנפרדת של RBPs כבול תעתיק מסוים בכל נקודת זמן קובעת העיבוד שלו, ובסופו של דבר את גורלה.
זיהוי של RBPs קשור mRNA עשוי לשפר באופן משמעותי את הבנתנו התהליכים שבבסיס תקנה שלאחר התעתיק שלהם. מגוונים גנטיים, מיקרוסקופי, שימשו שיטות ביוכימיות ביואינפורמטיקה לזהות חלבונים המעורבים בוויסות mRNA (הנסקרת ב 9-11). עם זאת, רק כמה שיטות אלה מאפשרים זיהוי של חלבונים הקשורים עם mRNA יעד מסוים. מן ראוי לציין כי הוא המערכת ההיברידית שמרים שלוש (Y3H), אשר מנצלת את ה- mRNA של עניין כפיתיון כדי להקרין ספריית ביטוי בתאי שמרים. שיבוטים חיוביים בדרך כלל הם נצפו באמצעות ביטוי בחירה או כתב צמיחת 12-14. היתרון העיקרי של שיטה זו הוא מספר רב של חלבונים כי ניתן לסרוק בסביבה הסלולר והיכולת למדוד את עוצמת האינטראקציה RNA-חלבון. חסרונות כוללים מספר הגדול יחסית של תוצאות חיוביות שגויות עקב מחייב הלא ספציפי, ואת הפוטנציאל הגבוה תוצאות שליליות שגויות נובעות, בין שאר, כדי misfolding של טרף חלבון היתוך או RNA הפיתיון.
חלופה לגישה הגנטית purifi זיקהקטיון של RNA עם החלבונים הקשורים שלה. פולי A-המכיל mRNAs ניתן לבודד באמצעות השימוש בעמודים dT אוליגו, וחלבונים הקשורים בהם מזוהים על ידי ספקטרומטריית מסה. האינטראקציה RNA חלבון נשמרת בהקשר הסלולר שלה על ידי crosslinking, מה שהופך קשרים קוולנטיים קצר-טווח. השימוש בעמודה אוליגו dT מניב בראיה גלובלית של proteome כולו המשויך כל פולי A-המכיל mRNA 3,5,15. עם זאת, זה אינו מספק רשימה של חלבונים הקשורים עם mRNA מסוים. מעט מאוד שיטות זמינות להשיג הזדהות כזאת. שיטת הזוג כרוכה transfection של חומצות גרעין עם השלמה ליעד mRNA 16,17. חומצת גרעין גם מחוברת פפטיד, אשר מאפשר crosslinking כדי RBPs באזור קרוב לאתר אינטראקציה. לאחר crosslinking, חומצת RBP-פפטיד-גרעין ניתן לבודד נתון ניתוח פרוטאומיקה. לאחרונה, מתודולוגיה מבוססת aptamer הייתהבהצלחה להחיל שואבת מן שורות תאים יונקות 18. Aptamer RNA עם זיקה משופרת streptavidin פותח התמזג רצף של עניין (אלמנט עשיר AU (ARE) במקרה זה). Aptamer-ARE RNA צורף חרוזים streptavidin ו מעורבב עם lysate התא. חלבונים כי קשור ההשתלשלות אינה טוהרו וזוהו על ידי ספקטרומטריית מסה (MS). אמנם שיטה זו זוהתה עמותות המתרחשות מחוץ הגדרות הסלולר (כלומר, במבחנה), היא עשויה להיות שונה בעתיד כדי להציג את aptamers לתוך הגנום ובכך לאפשר את הבידוד של חלבונים הקשורים mRNA בעוד המילייה הסלולר (כלומר, in vivo). בשמרים, שבו מניפולציות גנטיות מבוססות היטב, את השיטה המהירה (שפותחה במעבדתו של פרופ 'ג'ף Gerst) מספקת תצוגה של עמותות vivo ב -19. מהירה משלב הכריכה ספציפי וחזק של חלבון מעיל MS2 (MS2-CP) אל רצף הרנ"א MS2, ושל תחום מחייב streptavidin (SBP) streptavidin בשילוב חרוזים מצומדות. זה מאפשר טיהור יעילה של mRNAs מתויג MS2 באמצעות חרוזי streptavidin. יתר על כן, הביטוי של 12 עותקים של MS2 לולאות מאפשר עד שישה MS2-CPS להיקשר בו זמנית אל RNA ולהגדיל את יעילות הבידוד שלה. פרוטוקול זה ולכן הוצע לאפשר זיהוי של חלבונים הקשורים mRNA הרומן פעם דגימות eluted חשופים ניתוח proteomics ידי ספקטרומטריית מסה.
אנחנו לאחרונה מנוצלים מהירים לזהות חלבונים חדשים קשורים שמרים PMP1 mRNA 20. PMP1 mRNA הוצגה בעבר יקושר עם קרום ER וסביבתה 3 'המתורגמת (UTR) נמצאה להיות קובע עיקרי בשיתוף זה 21. לפיכך, RBPs אשר נקלט PMP1 3 'UTR צפוי לשחק תפקיד חשוב הלוקליזציה שלה. מהיר ובעקבותיו כרומטוגרף נוזליy-המוני ספקטרומטריית / ספקטרומטריית מסה (LC-MS / MS) גרמה לזיהויו של חלבונים חדשים רבים כי אינטראקציה עם PMP1 20. בזאת, אנו מספקים פרוטוקול מפורט של המתודולוגיה המהירה, שולטים חשוב שצריכים להיעשות, וטיפים טכניים שעלולות לשפר את התשואה וספציפית.
Protocol
Representative Results
Discussion
שיטות שונות להשתמש הבידוד של mRNAs ספציפי לזהות חלבונים הקשורים בהם 11,34 35. שיטות אלה חלות במבחנה אסטרטגיות vivo לחקור אינטראקציות RNA-חלבון. שיטות חוץ גופית דגירה עיבד אקסוגני RNA עם lysate התא כדי ללכוד RBPs ולבודד מתחמי RNP 36,37. גישה יעילה מסו?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים פרופ 'ג'ף Gerst ובוריס Slobodin עבור העצות המועילות שלהם בהקמת הפרוטוקול המהיר ומתן פלסמידים הדרושים. כמו כן, אנו מודים לד"ר אביגיל עתיר-לנדה על עזרתה בהקמת פרוטוקול זה וד"ר תמר זיו ממרכז פרוטאומיקה סמולר על עזרתה עם ניתוח LC-MS / MS. אנו מודים פרופ TG Kinzy (Rutgers) עבור נוגדן YEF3. עבודה זו נתמכה על ידי מענק 2011013 מהקרן הדו-לאומית למדע.
Materials
| Tris | sigma | T1503 | |
| SDS | bio-lab | 1981232300 | |
| DTT | sigma | D9779 | |
| Acidic Phenol (pH 4.3) | sigma | P4682 | |
| Acidic Phenol: Chloroform (5:1, pH 4.3) | sigma | P1944 | |
| Chloroform | bio-lab | 3080521 | |
| Formaldehyde | Frutarom | 5551820 | |
| Glycine | sigma | G7126 | |
| NP-40 | Calbiochem | 492016 | |
| Heparin | Sigma | H3393 | |
| Phenylmethylsulfonyl Flouride (PMSF) | Sigma | P7626 | |
| Leupeptin | Sigma | L2884 | |
| Aprotinin | Sigma | A1153 | |
| Soybean Trypsin Inhibitor | Sigma | T9003 | |
| Pepstatin | Sigma | P5318 | |
| DNase I | Promega | M610A | |
| Ribonuclease Inhibitor | Takara | 2313A | |
| Glass Beads | Sartorius | BBI-8541701 | 0.4-0.6mm diameter |
| Mini BeadBeater | BioSpec | Mini BeadBeater 16 | |
| Guanidinium | Sigma | G4505 | |
| Avidin | Sigma | A9275 | |
| Streptavidin Beads | GE Healthcare | 17-5113-01 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A7906 | |
| Yeast tRNA | Sigma | R8508 | |
| Biotin | Sigma | B4501 | |
| Yeast extract | Bacto | 288620 | |
| peptone | Bacto | 211677 | |
| Glucose | Sigma | G8270 | |
| 1 x Phosphate-Buffered saline (PBS) | |||
| 0.2 M NaOH | |||
| 4 x Laemmli Sample Buffer (LSB) | 0.2 M Tris-Hcl pH 6.8, 8% SDS, 0.4 M DTT, 40% glycerol, 0.04% Bromophenol-Blue. | ||
| Hot phenol lysis buffer | 10 mM Tris pH 7.5, 10 mM EDTA, 0.5% SDS | ||
| 3 M Sodium Acetate pH 5.2 | |||
| 100% and 70% Ethanol (EtOH) | |||
| RNase-free water | |||
| RaPID lysis buffer | 20 mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCl, 1.8 mM MgCl2, 0.5% NP-40, 5 mg/ml Heparin, 1 mM Dithiothreitol (DTT), 1 mM Phenylmethylsulfonyl Flouride (PMSF), 10 µg/ml Leupeptin, 10 µg/ml Aprotinin, 10 µg/ml Soybean Trypsin Inhibitor, 10 µg/ml Pepstatin, 20 U/ml DNase I, 100 U/ml Ribonuclease Inhibitor. | ||
| 2x Cross-linking reversal buffer | 100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA, 20 mM DTT, 2 % SDS. | ||
| RaPID wash buffer | 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 300 mM NaCl, 0.5% NP-40 | ||
| 0.5 M EDTA pH 8 | |||
| Silver Stain Plus Kit | Bio-Rad | 161-0449 | For detecting proteins in polyacrylamide gels |
| SD selective medium | 1.7 g/l Yeast nitrogen base with out amino acids and ammonium sulfate, 5 g/l Ammonium sulfate, 2% glucose, 350 mg/l Threonine, 40 mg/l Methionine, 40 mg/l Adenine, 50 mg/l Lysine, 50 mg/l Tryptophan, 20 mg/l Histidine, 80 mg/l Leucine, 30 mg/l Tyrosine, 40 mg/l Arginine | ||
| Anti-eEF3 (EF3A,YEF3) | Gift from Kinzy TG. (UMDNJ Robert Wood Johnson Medical School) | 1:5,000 | |
| Anti GFP antibody | Santa Cruz | sc-8334 | 1:3,000 |
| Anti rabbit IgG-HRP conjugated | SIGMA | A9169 | 1:10,000 |
References
- Hogan, D. J., Riordan, D. P., Gerber, A. P., Herschlag, D., Brown, P. O. Diverse RNA-binding proteins interact with functionally related sets of RNAs, suggesting an extensive regulatory system. PLoS Biol. 6, e255 (2008).
- Tsvetanova, N. G., Klass, D. M., Salzman, J., Brown, P. O. Proteome-wide search reveals unexpected RNA-binding proteins in Saccharomyces cerevisiae. PloS One. 5, (2010).
- Castello, A., et al. Insights into RNA biology from an atlas of mammalian mRNA-binding proteins. Cell. 149, 1393-1406 (2012).
- Gerstberger, S., Hafner, M., Tuschl, T. A census of human RNA-binding proteins. Nat Rev Genet. 15, 829-845 (2014).
- Baltz, A. G., et al. The mRNA-bound proteome and its global occupancy profile on protein-coding transcripts. Mol Cell. 46, 674-690 (2012).
- Mitchell, S. F., Parker, R. Principles and properties of eukaryotic mRNPs. Mol Cell. 54, 547-558 (2014).
- Licatalosi, D. D., Darnell, R. B. RNA processing and its regulation: global insights into biological networks. Nat Rev Genet. 11, 75-87 (2010).
- Eliyahu, E., Lesnik, C., Arava, Y. The protein chaperone Ssa1 affects mRNA localization to the mitochondria. FEBS Lett. 586, 64-69 (2012).
- Ascano, M., Gerstberger, S., Tuschl, T. Multi-disciplinary methods to define RNA-protein interactions and regulatory networks. Curr Opin Genet Dev. 23, 20-28 (2013).
- Denman, R. B. mRNPs take shape by CLIPPING and PAIRING. BioEssays. 28, 1132-1143 (2006).
- McHugh, C. A., Russell, P., Guttman, M. Methods for comprehensive experimental identification of RNA-protein interactions. Genome Biol. 15, 203 (2014).
- Bernstein, D. S., Buter, N., Stumpf, C., Wickens, M. Analyzing mRNA-protein complexes using a yeast three-hybrid system. Methods. 26, 123-141 (2002).
- SenGupta, D. J., et al. A three-hybrid system to detect RNA-protein interactions in vivo. Proc Natl Acad Sci USA. 93, 8496-8501 (1996).
- Yosefzon, Y., et al. Divergent RNA binding specificity of yeast Puf2p. RNA. 17, 1479-1488 (2011).
- Mitchell, S. F., Jain, S., She, M., Parker, R. Global analysis of yeast mRNPs. Nat Struct Mol Biol. 20, 127-133 (2013).
- Zielinski, J., et al. In vivo identification of ribonucleoprotein-RNA interactions. Proc Natl Acad Sci USA. 103, 1557-1562 (2006).
- Bell, T. J., Eberwine, J. Live Cell Genomics: RNA Exon-Specific RNA-Binding Protein Isolation. Methods Mol Biol. 1324, 457-468 (2015).
- Leppek, K., Stoecklin, G. An optimized streptavidin-binding RNA aptamer for purification of ribonucleoprotein complexes identifies novel ARE-binding proteins. Nucleic Acids Res. 42, e13 (2014).
- Slobodin, B., Gerst, J. E. A novel mRNA affinity purification technique for the identification of interacting proteins and transcripts in ribonucleoprotein complexes. RNA. 16, 2277-2290 (2010).
- Samra, N., Atir-Lande, A., Pnueli, L., Arava, Y. The elongation factor eEF3 (Yef3) interacts with mRNA in a translation independent manner. BMC Mol Biol. 16, 17 (2015).
- Loya, A., et al. The 3′-UTR mediates the cellular localization of an mRNA encoding a short plasma membrane protein. RNA. 14, 1352-1365 (2008).
- Haim-Vilmovsky, L., Gadir, N., Herbst, R. H., Gerst, J. E. A genomic integration method for the simultaneous visualization of endogenous mRNAs and their translation products in living yeast. RNA. 17, 2249-2255 (2011).
- Eldad, N., Yosefzon, Y., Arava, Y. Identification and characterization of extensive intra-molecular associations between 3′-UTRs and their ORFs. Nucleic Acids Res. 36, 6728-6738 (2008).
- Slobodin, B., Gerst, J. E. RaPID: an aptamer-based mRNA affinity purification technique for the identification of RNA and protein factors present in ribonucleoprotein complexes. Methods Mol Biol. 714, 387-406 (2011).
- Schmitt, M. E., Brown, T. A., Trumpower, B. L. A rapid and simple method for preparation of RNA from Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Res. 18, 3091-3092 (1990).
- Eldad, N., Arava, Y. A ribosomal density-mapping procedure to explore ribosome positions along translating mRNAs. Methods Mol Biol. 419, 231-242 (2008).
- Arava, Y., Seger, R., Fbeta Walker, M. D. GRFbeta, a novel regulator of calcium signaling, is expressed in pancreatic beta cells and brain. J Biol Chem. 274, 24449-24452 (1999).
- Arava, Y., Adamsky, K., Ezerzer, C., Ablamunits, V., Walker, M. D. Specific gene expression in pancreatic beta-cells: cloning and characterization of differentially expressed genes. Diabetes. 48, 552-556 (1999).
- Bavli-Kertselli, I., Melamed, D., Bar-Ziv, L., Volf, H., Arava, Y. Overexpression of eukaryotic initiation factor 5 rescues the translational defect of tpk1w in a manner that necessitates a novel phosphorylation site. FEBS J. 282, 504-520 (2015).
- Eliyahu, E., Melamed, D., Arava, Y. Genome-wide analysis of RNA extracted from isolated mitochondria. Methods Mol Biol. 714, 287-299 (2011).
- Brunelle, J. L., Green, R. One-dimensional SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (1D SDS-PAGE). Methods Enzymol. 541, 151-159 (2014).
- Gundry, R. L., et al. Preparation of proteins and peptides for mass spectrometry analysis in a bottom-up proteomics workflow. Current protocols in molecular biology. Chapter 10, Unit 10.25 (2009).
- Medzihradszky, K. F. In-solution digestion of proteins for mass spectrometry. Methods Enzymol. 405, 50-65 (2005).
- Bachler, M., Schroeder, R., von Ahsen, U. StreptoTag: a novel method for the isolation of RNA-binding proteins. RNA. 5, 1509-1516 (1999).
- Oeffinger, M. Two steps forward–one step back: advances in affinity purification mass spectrometry of macromolecular complexes. Proteomics. 12, 1591-1608 (2012).
- Ross, A. F., Oleynikov, Y., Kislauskis, E. H., Taneja, K. L., Singer, R. H. Characterization of a beta-actin mRNA zipcode-binding protein. Mol Cell Biol. 17, 2158-2165 (1997).
- Deshler, J. O., Highett, M. I., Schnapp, B. J. Localization of Xenopus Vg1 mRNA by Vera protein and the endoplasmic reticulum. Science. 276, 1128-1131 (1997).
- Bertrand, E., et al. Localization of ASH1 mRNA particles in living yeast. Mol Cell. 2, 437-445 (1998).
- Aizer, A., et al. Quantifying mRNA targeting to P-bodies in living human cells reveals their dual role in mRNA decay and storage. J Cell Sci. 127, 4443-4456 (2014).
- Gadir, N., Haim-Vilmovsky, L., Kraut-Cohen, J., Gerst, J. E. Localization of mRNAs coding for mitochondrial proteins in the yeast Saccharomyces cerevisiae. RNA. 17, 1551-1565 (2011).
- Lopez de Heredia, ., M, R. P., Jansen, RNA integrity as a quality indicator during the first steps of RNP purifications : a comparison of yeast lysis methods. BMC Biochem. 5, 14 (2004).
- Lee, J. S., Kallehauge, T. B., Pedersen, L. E., Kildegaard, H. F. Site-specific integration in CHO cells mediated by CRISPR/Cas9 and homology-directed DNA repair pathway. Sci Rep. 5, 8572 (2015).
- Auer, T. O., Duroure, K., De Cian, A., Concordet, J. P., Del Bene, F. Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated knock-in in zebrafish by homology-independent DNA repair. Genome Res. 24, 142-153 (2014).
- Oda, Y., Huang, K., Cross, F. R., Cowburn, D., Chait, B. T. Accurate quantitation of protein expression and site-specific phosphorylation. Proc Natl Acad Sci USA. 96, 6591-6596 (1999).
- de Godoy, L. M. SILAC yeast: from labeling to comprehensive proteome quantification. Methods Mol Biol. 1156, 81-109 (2014).
