RNA-protein interactions lie at the heart of many cellular processes. Here, we describe an in vivo method to isolate specific RNA and identify novel proteins that are associated with it. This could shed new light on how RNAs are regulated in the cell.
RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern biology. Only a few in vitro and in vivo methods enable the identification of RBPs associated with a particular target mRNA. However, their main limitations are the identification of RBPs in a non-cellular environment (in vitro) or the low efficiency isolation of RNA of interest (in vivo). An RNA-binding protein purification and identification (RaPID) methodology was designed to overcome these limitations in yeast and enable efficient isolation of proteins that are associated in vivo. To achieve this, the RNA of interest is tagged with MS2 loops, and co-expressed with a fusion protein of an MS2-binding protein and a streptavidin-binding protein (SBP). Cells are then subjected to crosslinking and lysed, and complexes are isolated through streptavidin beads. The proteins that co-purify with the tagged RNA can then be determined by mass spectrometry. We recently used this protocol to identify novel proteins associated with the ER-associated PMP1 mRNA. Here, we provide a detailed protocol of RaPID, and discuss some of its limitations and advantages.
Protéines liant l'ARN (RBP) représentent environ 10% de S. protéines cerevisiae 1,2 et environ 15% de protéines de mammifères 3-5. Ils sont impliqués dans de nombreux processus cellulaires tels que le traitement de l'ARNm post-transcriptionnelle et de régulation, la traduction, la biogenèse des ribosomes, ARNt aminoacylation et modification, remodelage de la chromatine, et plus encore. Un sous – groupe important de la RBP est les protéines d'ARNm de liaison (mRNP) 6,7. Au cours de l' ARNm maturation, différentes RBP lient la transcription et la médiation de son traitement nucléaire, l' exportation hors du noyau, la localisation cellulaire, la traduction et la dégradation 6-8. Ainsi, l'ensemble distinct de pratiques commerciales restrictives liées à une transcription particulière à tout point de temps détermine son traitement et, finalement, son sort.
L'identification des pratiques commerciales restrictives associées à un ARNm pourrait améliorer considérablement notre compréhension des processus qui sous-tendent leur régulation post-transcriptionnelle. Diverse génétique,, Les méthodes bio – informatiques biochimiques et microscopiques ont été utilisées pour identifier des protéines impliquées dans la régulation de l' ARNm (revu dans 9-11). Cependant, seulement quelques-unes de ces méthodes ne permettent l'identification de protéines associées à un ARNm cible particulier. Il est à noter la levure Trois système hybride (Y3H), qui utilise l'ARNm d'intérêt comme appât pour cribler une banque d'expression dans les cellules de levure. Les clones positifs sont généralement observés à travers une expression de sélection de croissance ou reporter 12-14. Le principal avantage de cette méthode est le grand nombre de protéines qui peuvent être scannés dans un environnement cellulaire et la capacité de mesurer la force de l'interaction ARN-protéine. Les inconvénients comprennent le nombre relativement élevé de résultats faussement positifs en raison de la liaison non spécifique, et le potentiel élevé de résultats faussement négatifs dus, en partie, à repliement de la proie de protéine de fusion ou l'ARN appât.
Une alternative à l'approche génétique est purifi affinitécation de l'ARN avec ses protéines associées. Poly A contenant des ARNm peut être isolé en utilisant des colonnes d'oligo dT et de leurs protéines associées sont détectées par spectrométrie de masse. L'interaction ARN-protéine est conservée dans son contexte cellulaire par réticulation, ce qui rend à courte portée des liaisons covalentes. L'utilisation de la colonne oligo dT donne une vue globale de l'ensemble du protéome qui est associé à une poly A-ARNm contenant 3,5,15. Toutefois, cela ne constitue pas une liste des protéines qui sont associées à un ARNm particulier. Très peu de méthodes sont disponibles pour accomplir une telle identification. La méthode PAIRE implique la transfection d'acide nucléique avec la complémentarité à l'ARNm cible 16,17. L'acide nucléique est également attaché à un peptide, ce qui permet de réticuler RBP à proximité immédiate du site d'interaction. Après réticulation, l'acide RBP-peptide-nucléique peut être isolé et soumis à une analyse protéomique. Récemment, une méthodologie fondée sur aptamère étaitappliquée avec succès à des extraits de lignées cellulaires de mammifères 18. Un aptamère d'ARN avec une meilleure affinité pour la streptavidine a été développée et fusionnée à une séquence d'intérêt (élément riche en AU (ARE) dans ce cas). L'aptamère-ARE L'ARN a été fixé à des billes de streptavidine et on le mélange avec le lysat cellulaire. Les protéines qui est associée à la séquence sont ont été purifiés et identifiés par spectrométrie de masse (MS). Bien que cette méthode a détecté des associations qui se produisent en dehors des paramètres cellulaires ( par exemple, in vitro), il est susceptible d'être modifiée ultérieurement , de manière à introduire les aptamères dans le génome et permettre ainsi l'isolement des protéines associées à l'ARNm tandis que dans le milieu cellulaire ( par exemple in vivo). Dans la levure, où les manipulations génétiques sont bien établies, la méthode RaPID (développé dans le laboratoire du professeur Jeff Gerst) fournit une vue des associations in vivo 19. RaPID combine la MS2- spécifique et forte liaison de la protéine d'enveloppe de MS2 (CP) à la séquence d'ARN de MS2 et du domaine de liaison à la streptavidine (SBP) à la streptavidine billes conjuguées. Cela permet une purification efficace des ARNm MS2-marqués par des billes de streptavidine. En outre, l'expression de 12 copies de MS2 boucles permet jusqu'à six MS2-CPs se lier simultanément à l'ARN et d'accroître l'efficacité de son isolement. Ce protocole a donc été proposé pour permettre l'identification de nouvelles protéines d'ARNm associé à la fois les échantillons éluées sont soumises à une analyse protéomique par spectrométrie de masse.
Nous avons récemment utilisé RaPID pour identifier de nouvelles protéines associées à la levure PMP1 ARNm 20. PMP1 ARNm a été montré précédemment à être associée à la membrane du RE et de sa région 3 'non traduite (UTR) a été trouvé pour être un déterminant majeur dans cette association 21. Ainsi, les pratiques commerciales restrictives qui lient PMP1 3 'UTR sont susceptibles de jouer un rôle important dans sa localisation. Rapide suivie chromatographe liquidey-spectrométrie de masse / spectrométrie de masse (LC-MS / MS) a abouti à l'identification de nombreuses nouvelles protéines qui interagissent avec PMP1 20. Ici, nous fournissons un protocole détaillé de la méthodologie RaPID, des contrôles importants qui doivent être faites, et des conseils techniques qui peuvent améliorer le rendement et la spécificité.
Diverses méthodes utilisent l'isolement des ARNm spécifiques pour identifier leurs protéines associées 11,34 35. Ces méthodes sont applicables in vitro et in vivo des stratégies pour sonder les interactions ARN-protéine. Incuber les méthodes in vitro avec l' ARN transcrit de manière exogène lysat cellulaire pour capturer RBP et isoler les complexes RNP 36,37. Une approche efficace de ce type a été présenté récemment, ce qui a permis l'…
The authors have nothing to disclose.
Nous remercions le Professeur Jeff Gerst et Boris Slobodin pour leurs conseils utiles pour la mise en place du protocole RaPID et en fournissant les plasmides nécessaires. Nous remercions également le Dr Avigail Atir-Lande pour son aide dans l'établissement de ce protocole et le Dr Tamar Ziv du Smoler Proteomics Centre pour son aide dans l'analyse LC-MS / MS. Nous remercions le Professeur TG Kinzy (Rutgers) pour l'anticorps YEF3. Ce travail a été soutenu par la subvention 2011013 de la Fondation binationale Science.
Tris | sigma | T1503 | |
SDS | bio-lab | 1981232300 | |
DTT | sigma | D9779 | |
Acidic Phenol (pH 4.3) | sigma | P4682 | |
Acidic Phenol: Chloroform (5:1, pH 4.3) | sigma | P1944 | |
Chloroform | bio-lab | 3080521 | |
Formaldehyde | Frutarom | 5551820 | |
Glycine | sigma | G7126 | |
NP-40 | Calbiochem | 492016 | |
Heparin | Sigma | H3393 | |
Phenylmethylsulfonyl Flouride (PMSF) | Sigma | P7626 | |
Leupeptin | Sigma | L2884 | |
Aprotinin | Sigma | A1153 | |
Soybean Trypsin Inhibitor | Sigma | T9003 | |
Pepstatin | Sigma | P5318 | |
DNase I | Promega | M610A | |
Ribonuclease Inhibitor | Takara | 2313A | |
Glass Beads | Sartorius | BBI-8541701 | 0.4-0.6mm diameter |
Mini BeadBeater | BioSpec | Mini BeadBeater 16 | |
Guanidinium | Sigma | G4505 | |
Avidin | Sigma | A9275 | |
Streptavidin Beads | GE Healthcare | 17-5113-01 | |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A7906 | |
Yeast tRNA | Sigma | R8508 | |
Biotin | Sigma | B4501 | |
Yeast extract | Bacto | 288620 | |
peptone | Bacto | 211677 | |
Glucose | Sigma | G8270 | |
1 x Phosphate-Buffered saline (PBS) | |||
0.2 M NaOH | |||
4 x Laemmli Sample Buffer (LSB) | 0.2 M Tris-Hcl pH 6.8, 8% SDS, 0.4 M DTT, 40% glycerol, 0.04% Bromophenol-Blue. | ||
Hot phenol lysis buffer | 10 mM Tris pH 7.5, 10 mM EDTA, 0.5% SDS | ||
3 M Sodium Acetate pH 5.2 | |||
100% and 70% Ethanol (EtOH) | |||
RNase-free water | |||
RaPID lysis buffer | 20 mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCl, 1.8 mM MgCl2, 0.5% NP-40, 5 mg/ml Heparin, 1 mM Dithiothreitol (DTT), 1 mM Phenylmethylsulfonyl Flouride (PMSF), 10 µg/ml Leupeptin, 10 µg/ml Aprotinin, 10 µg/ml Soybean Trypsin Inhibitor, 10 µg/ml Pepstatin, 20 U/ml DNase I, 100 U/ml Ribonuclease Inhibitor. | ||
2x Cross-linking reversal buffer | 100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA, 20 mM DTT, 2 % SDS. | ||
RaPID wash buffer | 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 300 mM NaCl, 0.5% NP-40 | ||
0.5 M EDTA pH 8 | |||
Silver Stain Plus Kit | Bio-Rad | 161-0449 | For detecting proteins in polyacrylamide gels |
SD selective medium | 1.7 g/l Yeast nitrogen base with out amino acids and ammonium sulfate, 5 g/l Ammonium sulfate, 2% glucose, 350 mg/l Threonine, 40 mg/l Methionine, 40 mg/l Adenine, 50 mg/l Lysine, 50 mg/l Tryptophan, 20 mg/l Histidine, 80 mg/l Leucine, 30 mg/l Tyrosine, 40 mg/l Arginine | ||
Anti-eEF3 (EF3A,YEF3) | Gift from Kinzy TG. (UMDNJ Robert Wood Johnson Medical School) | 1:5,000 | |
Anti GFP antibody | Santa Cruz | sc-8334 | 1:3,000 |
Anti rabbit IgG-HRP conjugated | SIGMA | A9169 | 1:10,000 |