Novel-RNA-bindende eiwitten Isolatie door de snelle Methodologie
Summary
RNA-protein interactions lie at the heart of many cellular processes. Here, we describe an in vivo method to isolate specific RNA and identify novel proteins that are associated with it. This could shed new light on how RNAs are regulated in the cell.
Abstract
RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern biology. Only a few in vitro and in vivo methods enable the identification of RBPs associated with a particular target mRNA. However, their main limitations are the identification of RBPs in a non-cellular environment (in vitro) or the low efficiency isolation of RNA of interest (in vivo). An RNA-binding protein purification and identification (RaPID) methodology was designed to overcome these limitations in yeast and enable efficient isolation of proteins that are associated in vivo. To achieve this, the RNA of interest is tagged with MS2 loops, and co-expressed with a fusion protein of an MS2-binding protein and a streptavidin-binding protein (SBP). Cells are then subjected to crosslinking and lysed, and complexes are isolated through streptavidin beads. The proteins that co-purify with the tagged RNA can then be determined by mass spectrometry. We recently used this protocol to identify novel proteins associated with the ER-associated PMP1 mRNA. Here, we provide a detailed protocol of RaPID, and discuss some of its limitations and advantages.
Introduction
RNA-bindende eiwitten (RBPs) vertegenwoordigen ongeveer 10% van S. cerevisiae eiwitten 1,2 en ongeveer 15% zoogdiereiwitten 3-5. Ze zijn betrokken bij vele cellulaire processen zoals mRNA post-transcriptie verwerking en regelgeving, vertaling, ribosoom biogenese, tRNA aminoacylering en modificatie, chromatine remodeling, en nog veel meer. Een belangrijke subgroep van RBPs is de mRNA-bindende eiwitten (mRNPs) 6,7. In de loop van mRNA rijping, verschillende RBPs binden het transcript en bemiddelen zijn nucleaire verwerking, export uit de nucleus, cellulaire lokalisatie, vertaling en degradatie 6-8. Zo is de afzonderlijke reeks RBPs gebonden aan een bepaalde transcript op elk tijdstip is bepalend voor de verwerking en uiteindelijk zijn lot.
De identificatie van RBPs geassocieerd met een mRNA kan een aanzienlijke verbetering van ons inzicht in de processen die ten grondslag liggen hun post-transcriptie regulatie. diverse genetische, Microscopische, biochemische en bioinformatica methoden zijn gebruikt om eiwitten betrokken bij regulatie mRNA (beoordeeld in 9-11) te identificeren. Slechts enkele van deze werkwijzen mogelijk zijn om eiwitten gekoppeld aan een specifiek doelwit mRNA. Opmerkelijk is de gist Drie hybridesysteem (Y3H), die gebruik maakt van mRNA van belang als lokaas om een expressiebibliotheek te screenen in gistcellen. Positieve klonen worden gewoonlijk waargenomen door een groeiselectie of reporterexpressie 12-14. Het belangrijkste voordeel van deze werkwijze is het groot aantal eiwitten die in een cellulaire omgeving en het vermogen om de sterkte van de RNA-eiwit interactie te meten kan worden gescand. Nadelen zijn het relatief grote aantal vals-positieve resultaten als gevolg van niet-specifieke binding en de hoge kans op vals negatieve resultaten ten dele, verkeerde vouwing van het fusieproteïne roof of aas RNA.
Een alternatief voor de genetische benadering affiniteit opzuiveringcatie van RNA met zijn geassocieerde eiwitten. PolyA bevattend mRNA kan worden geïsoleerd door middel van oligo dT kolommen en hun geassocieerde eiwitten worden gedetecteerd door middel van massaspectrometrie. Het RNA-eiwit interactie is geconserveerd in zijn cellulaire context door verknoping, die op korte afstand covalente bindingen maakt. Het gebruik van de oligo dT kolom geeft een globaal overzicht van het gehele proteoom die is gekoppeld aan een poly A-mRNA bevattende 3,5,15. Dit betekent echter geen volledig overzicht van eiwitten die zijn gekoppeld aan een bepaalde mRNA. Zeer weinig methoden beschikbaar om dergelijke identificatie bereiken. De PAIR methode is gebaseerd op de transfectie van nucleïnezuur complementair aan de doelwit mRNA 16,17. Het nucleïnezuur is ook verbonden met een peptide, die het mogelijk maakt om verknoping RBPs in dichte nabijheid van de interactieplaats. Na verknoping kunnen de RBP-peptide-nucleïnezuur worden geïsoleerd en onderworpen aan analyse proteomics. Onlangs, een van aptameergebaseerde methodiek wassucces toegepast op extracten van zoogdiercellijnen 18. Een RNA aptameer met verbeterde affiniteit voor streptavidine is ontwikkeld en gefuseerd aan een sequentie van belang (AU-rijk element (ARE) in dit geval). Het aptameer-ARE RNA werd gekoppeld aan streptavidine korrels en gemengd met cellysaat. Eiwitten die gekoppeld aan de ARE sequentie werden gezuiverd en geïdentificeerd door massaspectrometrie (MS). Hoewel deze methode ontdekt associaties die zich buiten de mobiele instellingen (bijvoorbeeld in vitro), is het waarschijnlijk in de toekomst worden gewijzigd om de aptameren introduceren in het genoom kunnen kopen, waardoor de isolatie van eiwitten geassocieerd met het mRNA terwijl in de cellulaire milieu (dat wil zeggen, in vivo). In gist, waarbij genetische manipulaties goed zijn gevestigd, de snelle methode (ontwikkeld in Prof. Jeff Gerst's lab) geeft een beeld van de in vivo verenigingen 19. Rapid combineert de specifieke en sterke binding van het MS2 manteleiwit (MS2-CP) naar het MS2-RNA-sequentie, en de streptavidine-bindende domein (SBP) om geconjugeerde streptavidine beads. Dit maakt efficiënte zuivering van MS2-mRNA's hebben met streptavidine beads. Bovendien, de expressie van 12 exemplaren van MS2 lussen kunnen maximaal zes MS2-CP's gelijktijdig binden aan het RNA en verhoging van de efficiëntie van haar isolement. Dit protocol werd daarom voorgesteld om de identificatie van nieuwe mRNA-geassocieerde eiwitten mogelijk zodra de geëlueerde monsters worden onderworpen aan proteomics analyse met massaspectrometrie.
We hebben onlangs gebruikt om snelle nieuwe eiwitten geassocieerd met de gist PMP1 mRNA 20 identificeren. PMP1 mRNA werd eerder aangetoond geassocieerd te zijn met de ER membraan en het 3 'onvertaalde gebied (UTR) bleek een belangrijke determinant in dit verband 21 zijn. Aldus RBPs dat PMP1 3 'UTR binden waarschijnlijk een belangrijke rol spelen bij de lokalisatie. Snelle gevolgd door vloeistofchromatografiey-massaspectrometrie / massaspectrometrie (LC-MS / MS) resulteerde in de identificatie van vele nieuwe eiwitten die interageren met PMP1 20. Hierin geven we een gedetailleerd protocol van de snelle methode, belangrijke controles die moeten worden gedaan, en technische tips dat de opbrengst en specificiteit kunnen verbeteren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Verschillende methoden de isolatie van specifieke mRNAs hun geassocieerde eiwitten 11,34 35 identificeren. Deze werkwijzen passen in vitro en in vivo strategieën RNA-eiwitinteracties sonde. In vitro werkwijzen Incubeer exogeen RNA getranscribeerd met cellysaat te isoleren RBPs vangen en RNP-complexen 36,37. Een effectieve aanpak van dit type werd onlangs gepresenteerd, die de identificatie van nieuwe eiwitten die een regulerende RNA-motief 18 binden…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Prof. Jeff Gerst en Boris Slobodin voor hun nuttige adviezen bij het opzetten van de snelle protocol en het verstrekken van de noodzakelijke plasmiden. We danken ook dr Avigail Atir-Lande voor haar hulp bij het vaststellen van dit protocol en Dr Tamar Ziv uit de Smoler Proteomics Center voor haar hulp bij de LC-MS / MS analyse. Wij danken Prof. TG Kinzy (Rutgers) voor de YEF3 antilichaam. Dit werk werd ondersteund door subsidie 2011013 van de binationale Science Foundation.
Materials
| Tris | sigma | T1503 | |
| SDS | bio-lab | 1981232300 | |
| DTT | sigma | D9779 | |
| Acidic Phenol (pH 4.3) | sigma | P4682 | |
| Acidic Phenol: Chloroform (5:1, pH 4.3) | sigma | P1944 | |
| Chloroform | bio-lab | 3080521 | |
| Formaldehyde | Frutarom | 5551820 | |
| Glycine | sigma | G7126 | |
| NP-40 | Calbiochem | 492016 | |
| Heparin | Sigma | H3393 | |
| Phenylmethylsulfonyl Flouride (PMSF) | Sigma | P7626 | |
| Leupeptin | Sigma | L2884 | |
| Aprotinin | Sigma | A1153 | |
| Soybean Trypsin Inhibitor | Sigma | T9003 | |
| Pepstatin | Sigma | P5318 | |
| DNase I | Promega | M610A | |
| Ribonuclease Inhibitor | Takara | 2313A | |
| Glass Beads | Sartorius | BBI-8541701 | 0.4-0.6mm diameter |
| Mini BeadBeater | BioSpec | Mini BeadBeater 16 | |
| Guanidinium | Sigma | G4505 | |
| Avidin | Sigma | A9275 | |
| Streptavidin Beads | GE Healthcare | 17-5113-01 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A7906 | |
| Yeast tRNA | Sigma | R8508 | |
| Biotin | Sigma | B4501 | |
| Yeast extract | Bacto | 288620 | |
| peptone | Bacto | 211677 | |
| Glucose | Sigma | G8270 | |
| 1 x Phosphate-Buffered saline (PBS) | |||
| 0.2 M NaOH | |||
| 4 x Laemmli Sample Buffer (LSB) | 0.2 M Tris-Hcl pH 6.8, 8% SDS, 0.4 M DTT, 40% glycerol, 0.04% Bromophenol-Blue. | ||
| Hot phenol lysis buffer | 10 mM Tris pH 7.5, 10 mM EDTA, 0.5% SDS | ||
| 3 M Sodium Acetate pH 5.2 | |||
| 100% and 70% Ethanol (EtOH) | |||
| RNase-free water | |||
| RaPID lysis buffer | 20 mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCl, 1.8 mM MgCl2, 0.5% NP-40, 5 mg/ml Heparin, 1 mM Dithiothreitol (DTT), 1 mM Phenylmethylsulfonyl Flouride (PMSF), 10 µg/ml Leupeptin, 10 µg/ml Aprotinin, 10 µg/ml Soybean Trypsin Inhibitor, 10 µg/ml Pepstatin, 20 U/ml DNase I, 100 U/ml Ribonuclease Inhibitor. | ||
| 2x Cross-linking reversal buffer | 100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA, 20 mM DTT, 2 % SDS. | ||
| RaPID wash buffer | 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 300 mM NaCl, 0.5% NP-40 | ||
| 0.5 M EDTA pH 8 | |||
| Silver Stain Plus Kit | Bio-Rad | 161-0449 | For detecting proteins in polyacrylamide gels |
| SD selective medium | 1.7 g/l Yeast nitrogen base with out amino acids and ammonium sulfate, 5 g/l Ammonium sulfate, 2% glucose, 350 mg/l Threonine, 40 mg/l Methionine, 40 mg/l Adenine, 50 mg/l Lysine, 50 mg/l Tryptophan, 20 mg/l Histidine, 80 mg/l Leucine, 30 mg/l Tyrosine, 40 mg/l Arginine | ||
| Anti-eEF3 (EF3A,YEF3) | Gift from Kinzy TG. (UMDNJ Robert Wood Johnson Medical School) | 1:5,000 | |
| Anti GFP antibody | Santa Cruz | sc-8334 | 1:3,000 |
| Anti rabbit IgG-HRP conjugated | SIGMA | A9169 | 1:10,000 |
References
- Hogan, D. J., Riordan, D. P., Gerber, A. P., Herschlag, D., Brown, P. O. Diverse RNA-binding proteins interact with functionally related sets of RNAs, suggesting an extensive regulatory system. PLoS Biol. 6, e255 (2008).
- Tsvetanova, N. G., Klass, D. M., Salzman, J., Brown, P. O. Proteome-wide search reveals unexpected RNA-binding proteins in Saccharomyces cerevisiae. PloS One. 5, (2010).
- Castello, A., et al. Insights into RNA biology from an atlas of mammalian mRNA-binding proteins. Cell. 149, 1393-1406 (2012).
- Gerstberger, S., Hafner, M., Tuschl, T. A census of human RNA-binding proteins. Nat Rev Genet. 15, 829-845 (2014).
- Baltz, A. G., et al. The mRNA-bound proteome and its global occupancy profile on protein-coding transcripts. Mol Cell. 46, 674-690 (2012).
- Mitchell, S. F., Parker, R. Principles and properties of eukaryotic mRNPs. Mol Cell. 54, 547-558 (2014).
- Licatalosi, D. D., Darnell, R. B. RNA processing and its regulation: global insights into biological networks. Nat Rev Genet. 11, 75-87 (2010).
- Eliyahu, E., Lesnik, C., Arava, Y. The protein chaperone Ssa1 affects mRNA localization to the mitochondria. FEBS Lett. 586, 64-69 (2012).
- Ascano, M., Gerstberger, S., Tuschl, T. Multi-disciplinary methods to define RNA-protein interactions and regulatory networks. Curr Opin Genet Dev. 23, 20-28 (2013).
- Denman, R. B. mRNPs take shape by CLIPPING and PAIRING. BioEssays. 28, 1132-1143 (2006).
- McHugh, C. A., Russell, P., Guttman, M. Methods for comprehensive experimental identification of RNA-protein interactions. Genome Biol. 15, 203 (2014).
- Bernstein, D. S., Buter, N., Stumpf, C., Wickens, M. Analyzing mRNA-protein complexes using a yeast three-hybrid system. Methods. 26, 123-141 (2002).
- SenGupta, D. J., et al. A three-hybrid system to detect RNA-protein interactions in vivo. Proc Natl Acad Sci USA. 93, 8496-8501 (1996).
- Yosefzon, Y., et al. Divergent RNA binding specificity of yeast Puf2p. RNA. 17, 1479-1488 (2011).
- Mitchell, S. F., Jain, S., She, M., Parker, R. Global analysis of yeast mRNPs. Nat Struct Mol Biol. 20, 127-133 (2013).
- Zielinski, J., et al. In vivo identification of ribonucleoprotein-RNA interactions. Proc Natl Acad Sci USA. 103, 1557-1562 (2006).
- Bell, T. J., Eberwine, J. Live Cell Genomics: RNA Exon-Specific RNA-Binding Protein Isolation. Methods Mol Biol. 1324, 457-468 (2015).
- Leppek, K., Stoecklin, G. An optimized streptavidin-binding RNA aptamer for purification of ribonucleoprotein complexes identifies novel ARE-binding proteins. Nucleic Acids Res. 42, e13 (2014).
- Slobodin, B., Gerst, J. E. A novel mRNA affinity purification technique for the identification of interacting proteins and transcripts in ribonucleoprotein complexes. RNA. 16, 2277-2290 (2010).
- Samra, N., Atir-Lande, A., Pnueli, L., Arava, Y. The elongation factor eEF3 (Yef3) interacts with mRNA in a translation independent manner. BMC Mol Biol. 16, 17 (2015).
- Loya, A., et al. The 3′-UTR mediates the cellular localization of an mRNA encoding a short plasma membrane protein. RNA. 14, 1352-1365 (2008).
- Haim-Vilmovsky, L., Gadir, N., Herbst, R. H., Gerst, J. E. A genomic integration method for the simultaneous visualization of endogenous mRNAs and their translation products in living yeast. RNA. 17, 2249-2255 (2011).
- Eldad, N., Yosefzon, Y., Arava, Y. Identification and characterization of extensive intra-molecular associations between 3′-UTRs and their ORFs. Nucleic Acids Res. 36, 6728-6738 (2008).
- Slobodin, B., Gerst, J. E. RaPID: an aptamer-based mRNA affinity purification technique for the identification of RNA and protein factors present in ribonucleoprotein complexes. Methods Mol Biol. 714, 387-406 (2011).
- Schmitt, M. E., Brown, T. A., Trumpower, B. L. A rapid and simple method for preparation of RNA from Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Res. 18, 3091-3092 (1990).
- Eldad, N., Arava, Y. A ribosomal density-mapping procedure to explore ribosome positions along translating mRNAs. Methods Mol Biol. 419, 231-242 (2008).
- Arava, Y., Seger, R., Fbeta Walker, M. D. GRFbeta, a novel regulator of calcium signaling, is expressed in pancreatic beta cells and brain. J Biol Chem. 274, 24449-24452 (1999).
- Arava, Y., Adamsky, K., Ezerzer, C., Ablamunits, V., Walker, M. D. Specific gene expression in pancreatic beta-cells: cloning and characterization of differentially expressed genes. Diabetes. 48, 552-556 (1999).
- Bavli-Kertselli, I., Melamed, D., Bar-Ziv, L., Volf, H., Arava, Y. Overexpression of eukaryotic initiation factor 5 rescues the translational defect of tpk1w in a manner that necessitates a novel phosphorylation site. FEBS J. 282, 504-520 (2015).
- Eliyahu, E., Melamed, D., Arava, Y. Genome-wide analysis of RNA extracted from isolated mitochondria. Methods Mol Biol. 714, 287-299 (2011).
- Brunelle, J. L., Green, R. One-dimensional SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (1D SDS-PAGE). Methods Enzymol. 541, 151-159 (2014).
- Gundry, R. L., et al. Preparation of proteins and peptides for mass spectrometry analysis in a bottom-up proteomics workflow. Current protocols in molecular biology. Chapter 10, Unit 10.25 (2009).
- Medzihradszky, K. F. In-solution digestion of proteins for mass spectrometry. Methods Enzymol. 405, 50-65 (2005).
- Bachler, M., Schroeder, R., von Ahsen, U. StreptoTag: a novel method for the isolation of RNA-binding proteins. RNA. 5, 1509-1516 (1999).
- Oeffinger, M. Two steps forward–one step back: advances in affinity purification mass spectrometry of macromolecular complexes. Proteomics. 12, 1591-1608 (2012).
- Ross, A. F., Oleynikov, Y., Kislauskis, E. H., Taneja, K. L., Singer, R. H. Characterization of a beta-actin mRNA zipcode-binding protein. Mol Cell Biol. 17, 2158-2165 (1997).
- Deshler, J. O., Highett, M. I., Schnapp, B. J. Localization of Xenopus Vg1 mRNA by Vera protein and the endoplasmic reticulum. Science. 276, 1128-1131 (1997).
- Bertrand, E., et al. Localization of ASH1 mRNA particles in living yeast. Mol Cell. 2, 437-445 (1998).
- Aizer, A., et al. Quantifying mRNA targeting to P-bodies in living human cells reveals their dual role in mRNA decay and storage. J Cell Sci. 127, 4443-4456 (2014).
- Gadir, N., Haim-Vilmovsky, L., Kraut-Cohen, J., Gerst, J. E. Localization of mRNAs coding for mitochondrial proteins in the yeast Saccharomyces cerevisiae. RNA. 17, 1551-1565 (2011).
- Lopez de Heredia, ., M, R. P., Jansen, RNA integrity as a quality indicator during the first steps of RNP purifications : a comparison of yeast lysis methods. BMC Biochem. 5, 14 (2004).
- Lee, J. S., Kallehauge, T. B., Pedersen, L. E., Kildegaard, H. F. Site-specific integration in CHO cells mediated by CRISPR/Cas9 and homology-directed DNA repair pathway. Sci Rep. 5, 8572 (2015).
- Auer, T. O., Duroure, K., De Cian, A., Concordet, J. P., Del Bene, F. Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated knock-in in zebrafish by homology-independent DNA repair. Genome Res. 24, 142-153 (2014).
- Oda, Y., Huang, K., Cross, F. R., Cowburn, D., Chait, B. T. Accurate quantitation of protein expression and site-specific phosphorylation. Proc Natl Acad Sci USA. 96, 6591-6596 (1999).
- de Godoy, L. M. SILAC yeast: from labeling to comprehensive proteome quantification. Methods Mol Biol. 1156, 81-109 (2014).
