Usando resposta ao toque evocadas e locomoção Os ensaios para avaliar o desempenho muscular e funcional de Zebrafish
Summary
Zebrafish are an excellent model to study muscle function and disease. During early embryogenesis zebrafish begin regular muscle contractions producing rhythmic swimming behavior, which is altered when the muscle is disrupted. Here we describe a touch-evoked response and locomotion assay to examine swimming performance as a measure of muscle function.
Abstract
desenvolvimento muscular Zebrafish é altamente conservada com sistemas de mamíferos, tornando-os um excelente modelo para estudar a função muscular e doença. Muitas miopatias que afetam a função do músculo esquelético pode ser rápida e facilmente avaliada no peixe-zebra ao longo dos primeiros dias da embriogênese. Por 24 horas pós-fertilização (hpf), wildtype peixe-zebra espontaneamente contrair seus músculos da cauda e em 48 hpf, comportamentos de natação controlada apresentam peixe-zebra. Redução na frequência de, ou outras alterações nos, esses movimentos podem indicar uma disfunção do músculo esquelético. Para analisar o comportamento de natação e avaliar o desempenho muscular no desenvolvimento do peixe-zebra no início, nós utilizamos ambos os ensaios de resposta e locomoção de fuga evocada pelo toque.
ensaios de resposta de fuga evocada-Touch pode ser usado para avaliar o desempenho muscular durante os movimentos de ruptura curtas resultantes da contração das fibras musculares de contração rápida. Em resposta a um estímulo externo, o qual neste caso é uma torneira decabeça, peixe-zebra tipo selvagem em 2 dias pós-fertilização (DPF) normalmente exibem um poderoso mergulho explosão, acompanhada de curvas fechadas. O nosso método quantifica a função do músculo esquelético através da medição da aceleração máxima durante um movimento de ruptura natação, a aceleração sendo directamente proporcional à força produzida pela contração muscular.
Em contraste, os testes de locomoção durante o desenvolvimento das larvas de peixe-zebra cedo são utilizados para avaliar o desempenho muscular durante períodos prolongados de actividade muscular. Usando um sistema de rastreamento para monitorar o comportamento de natação, obtém-se um cálculo automatizado da frequência de atividade e distância em 6 dias zebrafish de idade, reflexo de sua função do músculo esquelético. As medições de desempenho natação são valiosas para a avaliação fenotipica de modelos de doenças e de rastreio de alto rendimento de mutações ou tratamentos químicos que afectam a função do músculo esquelético.
Introduction
Ao longo da última década peixe-zebra tem sido cada vez mais usado para estudar a biologia das células musculares e doenças. O desenvolvimento rápido externo do embrião do peixe-zebra, juntamente com a sua clareza óptica, permite a visualização directa da formação de músculo, crescimento e função. O processo de desenvolvimento muscular é altamente conservada no peixe-zebra e isto permitiu a modelagem bem sucedida de uma gama de doenças musculares incluindo distrofias musculares e miopatias congénitas 1-8. A análise detalhada dos modelos de peixe-zebra tem não só proporciona novos insights sobre a pathobiology destas condições, mas também proporcionou uma plataforma para o teste de terapias adequadas 6,9-13.
A análise de modelos de peixe-zebra de doenças musculares depende de ensaios confiáveis e reprodutíveis para medir o desempenho muscular. Estudos anteriores já haviam medido com sucesso a capacidade de geração de força do músculo tronco peixe-zebra em peixes entre 3 e 7 dpf porestimular eletricamente contração de um peixe do imobilizado ligado a um sistema de forças de transdução de 14. Isto pode fornecer medições detalhadas de força, mas não são ideais para experimentos de rendimento mais elevados e há vantagens para medir o desempenho muscular durante a natação. Às 2 dpf muscular peixe-zebra é totalmente funcional e os peixes podem provocar movimentos explosão de natação em resposta a estímulos. O ensaio de resposta de fuga toque-evocar é usado para medir a aceleração durante um movimento de ruptura natação, que pode ser usado como uma medida da força contráctil.
Uma das medidas mais utilizadas da função muscular em pacientes com miopatia é o teste de caminhada de 6 min, que registra a distância total percorrida em uma superfície plana e dura 15,16. Nós aplicamos um teste semelhante para medir a função muscular em 6 dpf larvas do peixe, que nos monitorar a distância total nadado, eo número total de movimentos realizados por cada larva por um período de 10 min. Esta é realizadausando um sistema de seguimento automático, que permite medições fiáveis e de alto rendimento de desempenho muscular. Ambos os testes musculares são altamente reprodutíveis e têm sido usados para quantificar as diferenças no desempenho muscular em modelos miopatia zebrafish 8.
Protocol
Representative Results
Discussion
Muitos modelos animais diferentes, incluindo ratos, cães, peixes-zebra, moscas e vermes têm contribuído para o nosso entendimento da base genética e molecular de doenças musculares, e ajudou no desenvolvimento de abordagens terapêuticas para combatê-las. O peixe-zebra possui várias vantagens para o estudo da doença muscular. O peixe-zebra fornece um sistema geneticamente manipulável para avaliar padrões músculo complexa em um ambiente fisiológico adequado, o que não é possível em sistemas de cultura in vitro. Ao contrário de outros modelos animais vertebrados, o grande número de peixes produzidos, juntamente com a sua claridade óptica, facilita a rápida, de alto rendimento em química vivo e rastreio genético.
Aqui nós descrevemos o desenvolvimento de ensaios de circulação de peixe-zebra para fornecer um alto throughput e método automatizado para avaliar o desempenho muscular durante a embriogênese peixe-zebra. Para ambos os ensaios deve-se reconhecer que os ritmos circadianos eestímulos ambientais externos irá afectar significativamente o comportamento de natação do peixe-zebra 17,18. Teste repetido do mesmo peixe-zebra também irá conduzir a habituação causando uma diminuição da resposta ao estímulo táctil 23. Por conseguinte, a fim de obter resultados reprodutíveis entre experiências, cada embrião do peixe-zebra só deve ser testado uma vez, o tempo de dia e as condições de iluminação deve ser normalizada, e a temperatura da água tem de ser fortemente regulada.
Usando o toque evocado análise em 2 dpf podemos medir directamente a aceleração máxima de uma acção de ruptura de natação, a qual é proporcional à força muscular. As técnicas anteriores em peixes-zebra foram examinados força muscular, amarrando ambas as extremidades dos embriões a seguinte equipamento experimental que a contração do músculo é estimulado utilizando um campo eléctrico e a capacidade de geração de força do músculo 14 é medido. Embora este método mede a força de capacidade de geração de tele muscular larval, não mede a força real gerada pelo músculo larval durante a natação. Assim, desenvolvemos um método para avaliar indirectamente a força gerada durante o movimento normal de natação das larvas para fornecer uma medida geral de saúde do músculo. O sistema de vídeo de alta velocidade, capaz de gravar os movimentos de peixe-zebra individuais em uma taxa de quadros de 1.000 frames / seg pode ser usado para identificar pequenas, mas significativas diferenças na função muscular, que não são diretamente distinguíveis a olho nu. Será de interesse para ver como relatado anteriormente mudanças na eletroestimulado força geração se correlacionam com mudanças no desempenho de natação.
Além disso, o toque evocado ensaios de resposta também pode ser usado para avaliar a cinemática de natação, tais como a forma e a velocidade de onda do corpo durante o movimento de natação 24, para dar uma medição quantitativa do comportamento locomotor.
Devido ao movimento espontâneo de zebraflarvas ish após 3 dpf, não fomos capazes de realizar os ensaios de toque-evocar para medir a função muscular. Por outro lado, nós medimos o desempenho muscular durante um longo período por determinação da distância nadada por larvas do peixe às 6 dpf. Este teste, embora uma medida indirecta da função muscular, pode ser utilizada para identificar peixes que apresentem o desempenho muscular prejudicada 8 ou neurodegeneração 25,26. Este teste não só fornece uma medição análoga ao teste de 6 min, mas é também adequado para automatizado de alto rendimento em telas de drogas ou de mutagénese in vivo.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Viewpoint for their kind sponsorship of this manuscript. This work was funded by an Australian National Health and Medical Research Council (NHMRC) Project Grant (APP1010110).
Materials
| 21G X 1' Blunt Needle | Terumo/Admiral Medical Supplies | TE2125 | |
| 48-well plates | Sigma | M8937 | |
| 90mm Petri Dishes | Pacific Laboratory Products PT | S90001 | |
| High Speed Camera | Baumer | HXC20 | |
| http://www.randomization.com | N/A | Steps 1.1.2, 2.1.3 | |
| Incubator | Thermoline Scientific | TEI-43L | |
| Plastic Pipette | VWR | 16001-188 | |
| StreamPix5 | NorPix | Step 1.2.3 | |
| Temperature Control Unit | Viewpoint | ||
| Tweezers, style 8 | ProSciTech | T04-821 | |
| Zebrabox System | Viewpoint | ||
| Zebralab | Viewpoint | Steps 1.3.1, 2.2.1 |
References
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