ゼブラフィッシュで筋肉のパフォーマンスと機能を評価するためにタッチ誘発応答と歩行アッセイを使用して

1.タッチ誘発応答アッセイタッチ誘発応答アッセイのための胚DPF 2の調製活動は一日17,18を通して劇的に変化させることができるので、テストが実施される時刻は、実験間で一貫していることを確認してください。 注：実験が行わ盲目にされるべきであり、試験の順序は実験的なアーティファクトを最小限にするために無作為化。 魚を割り当て実験を行う個人に不明な番号を、株。これに続いて、自由に利用できるオンラインツールを使用すると、テストの順序を指示するランダムなリストを生成します。 試験の前に少なくとも1時間、dechorionate胚絨毛膜に穴をリッピングし、静かに細かいピンセットを使って離れて絨毛膜を引っ張ることによって。 28℃のインキュベーターに戻る前にペトリ皿からごみを取り除きます。 タッチ誘発応答アッセイを実施ヒート駅28℃で少なくとも15分のGE試験を開始する前に。 注：この段階では、温度制御され、28のままになります テストの期間中にCを°。温度が活性に影響し、一定の温度を維持することが重要です。加熱されたステージを使用できない場合には、水の温度が監視されるべきであり、すべての実験は、同じ温度で行うべきです。 胚培地（5のNaCl、0.17mMのKCl、0.33mMのCaCl 2を、水中の0.33 mMのMgSO 4）し照らされ、ステージ上で満たされたペトリ皿を置き、ペトリ皿の上に高速度カメラをマウントします。 （例えば、ここで説明ストリームピックス5、のような）ビデオカメラの録画ソフトを起動し、「ワークスペース」タブの下に魚の高速遊泳のアクションが記録されていることを確認するためのキャプチャースピードとして毎秒千フレーム（千のfps）を選択します。 一度に一つの胚を使った作業、middに胚を置きます視野内のはっきりと見えるゼブラフィッシュとペトリ皿のル。 注：胚が離れて泳ぐ場合奪還と胚の位置付けは、それが刺激に鈍感にし、繰り返しバースト応答となって生じ得ることは、いくつかの疾患モデルにおける筋力低下を促進することができるように、実験前の開始に、別のと交換してください。 「記録」ボタンをクリックして録音を始め、頭の上に鈍い針で軽く触れることによって胚に機械刺激の刺激を提供します。 胚は視野の外に泳いや休息に戻った後に記録を停止します。 注：機械的刺激次のバーストのエスケープ応答の最初の0.2秒内の加速度ピーク。したがって、少なくとも魚を記録逃避反応の最初の0.2秒の間に視野内にあることを確認してください。ステップ1.2.3に記載されているソフトウェアを使用して、データが自動的に保存されます.AVIビデオファイルとして。このようなダウンロードのために自由に利用できますどちらも無料ビデオキャプチャやソフトニック、などの代替ビデオキャプチャソフトウェアを使用することもできます。 新しいペトリ皿に胚を戻し、テストのために別の胚を選択します。 15魚の最小値にテストを実行します。 遊泳行動の定量化遊泳行動を定量化するために、ソフトウェアを起動し、.aviファイル保存したビデオファイルを開くには、「バックグラウンド除去することなく、単一の幼虫ロコモーション」モジュールを選択します。 分析に使用される映画のメニューバーの選択領域から「フリーハンド」または「多角形」ツールを使用して。領域は魚の元の位置と魚が泳ぐになると面積の両方を包含することを確認してください。プローブは、分析されるべき領域から除外されていることを確認してください。ソフトウェアは自動的に所望の領域内の魚の軌跡を追跡します。 トンを実行するには彼の分析、メニューバーから「実験」をクリックし、「実行」を選択します。所望の位置に生データ分析ファイル（.phr形式）を保存するメッセージが表示されたら。保存された後、分析を開始するには、「スタート」をクリックしてください。 「実験」ドロップダウンメニューの下に「停止」をクリックして分析を終了します。結果を含むウィンドウが表示されます。 「最大加速度」の値を取得するために右にスクロールします。必要であれば、結果ウィンドウを閉じると、「結果」ドロップダウンメニューの下の「輸出瞬間結果」ボタンをクリックすることで、このデータをエクスポートします。適切な生データ分析ファイルを選択し、[開く]をクリックします。スプレッドシートプログラムで開くことができるテキストファイルが保存先のフォルダに保存されます。 各個々の魚や、各株の平均最大加速度を得るために平均的にこの処理を繰り返します （ 図1を参照）。 注：usinの代替としてGここで説明するソフトウェアは、自由に利用可能なImageJソフトウェアと同様のパッケージは、関連する動きデータを抽出するために使用することができます。 3次元粒子追跡プラグインは、水泳軌跡を追跡するために使用することができます。 2.歩行アッセイ – 10分水泳試験水泳分析のための胚DPF 6の調製必要に応じて、ソート胚必要な遺伝子型のため、例えば蛍光タンパク質の発現を調べることによって、または表現型によってであれば、独立したペトリ皿（皿当たり25-30胚）に配置します。あるいは、遺伝子型は移動アッセイの完了後に決定することができます。 3 DPFでは、ペトリ皿を再検討し、任意の未孵化胚および破片を除去します。 6 DPFまで28℃のインキュベーターにペトリ皿を返します。 ゼブラフィッシュの幼虫が最も活性である時刻である午前9時から午後12時、間のすべての株のテストを実行します。 Pにテストと位置の順番をランダム野生型および変異体サンプルの後半は、概日の違いや他の実験バイアスの影響を最小限に抑えることができます。 注：これは、アクティビティが終日劇的に変化することができるため、テスト時間が実験間で一貫していることが重要です。 試験前に少なくとも30分、ウェルあたり1幼虫で48ウェルプレートに場所の幼虫。水面がちょうどよくの最上部の下になるように転送した後、気泡がない確実に、井戸を埋めます。 28℃のインキュベーターにプレートを返します。 インキュベーターからプレートを取り出し、試験前に5分間光に順応。 歩行アッセイを行います幼虫は暗闇の中で検出することができるように、60フレーム/秒、最大取り込み、赤外線デジタルカメラが装備されている記録チャンバーへ48ウェルプレートを置きます。全てのウェルは、運動のソフトウェア上で円形グリッドの内側に配置されていることを確認し、すべての幼虫がCLEあることアルリー検出可能。 ソフトウェアを起動し、「追跡」モジュールを選択します。 「ファイル」の「生成する新しいプロトコル」をクリックして、実験に使用したウェルの数を編集します。テスト期間と「パラメータ」をクリックして、10分の積分期間の両方を設定するドロップダウンメニューと「プロトコルパラメータ」、続いて「時間」タブを選択します。同じ「プロトコルパラメータ」ダイアログボックスの「オプション」タブをクリックし、「Numeriscope」チェックボックスは、「プロトコル・パラメータ」ダイアログボックスを閉じることができ、次のようにクリックされたことを確認します。 記録領域を設定するには、ウェルの1にグリッド全体をダブルクリックを強調表示します。 「地域を描く」ボタンをクリックし、左上、右上、左下、ウェルの周りに描き、ソフトウェアが自動的に各ウェルの位置を決定することを可能にする「ビルド」をクリックします。またスケールで描きますバー、「グループに適用」をクリックしてください。完了したら、「領域を描画」ボタンをクリックします。 視覚だけで魚の動きが背景なし信号で強調表示されるレベルに「検出閾値」バーをスライドさせることにより検出閾値を決定します。 注記：検出閾値は、株の間で変化し、従って、閾値は、新しい株が試験されたときに決定されなければなりません。代表的なデータは25mmで検出閾値を提示で/秒を使用しました。 テストを開始する前に、非アクティブの検出、小規模および大規模な動きを移動しきい値を入力します。 注：代表的なデータでは6ミリメートル/秒の非アクティブのしきい値を発表し、30ミリメートル/秒の活動バーストしきい値を使用しました。しきい値は、最小動きがアクティブと見なされるべきかを決定し、必要なレベルは、バーストの活動を考慮し、（小さなアクティブにするがバーストactiviの下に活動の分類を可能にしますTYのしきい値）とバースト活動しきい値よりも大きい（大）の動き。閾値は、分析、特定の魚の株の活性に応じて変更することができます。 注：このアッセイは、光や暗い条件のいずれかで行うことができますが、ゼブラフィッシュの幼虫は暗い18でより積極的であることが示されています。 ドロップダウンメニュー「パラメータ」の「光駆動設定」ボタンをクリックすることで、0％になるように室内に光強度を設定します。結果のダイアログボックスで、必要な光の設定を追加します。 注：室内の光強度は、幼虫の活性を刺激するために試験時間中にオン・オフするようにトリガすることができます記録室のドアを閉じて、ビデオ録画を開始します。 遊泳行動の定量化実験が完了した後、「実験」ドロップダウンメニューの下に「停止」をクリックしてください。対話洪明甫すべての結果にxが表示されます。 Excelでこれらの結果にアクセスするには、「フォルダを含む開く」とその結果]フォルダに表示されたExcelファイルを開く]をクリックします。重要なパラメータは、「smlct」（小さな動きカウント）、「larct」（大運動回数）、「smldist」（小さな動きで魚で覆われた総距離）と「lardist「大きな動きで魚によってカバーさ（総距離です）。 注：録音後、ソフトウェアはまた、中の歩行運動の視覚的な表現を含む（（10分の記録のビデオを含む） の.aviファイルの形式と.pngの画像ファイル内に二つの追加の出力ファイルを返します。10-分実験; 図2）を参照してください。 歩行値が計算されると、正確に計算された運動値は魚の遊泳運動を描くかどうかを確認するためにaviファイルと.pngのファイルを再生（ 図を参照してください3）。 注：ここで説明するソフトウェアを使用する代わりに、そのような自由に利用可能なImageJソフトウェアとしてパッケージは運動器官の行動を追跡するために使用することができます。