Mit Touch-evozierte Reaktion und Locomotion Assays zur Beurteilung der Muskelleistung und Funktion in Zebrabärbling
Summary
Zebrafish are an excellent model to study muscle function and disease. During early embryogenesis zebrafish begin regular muscle contractions producing rhythmic swimming behavior, which is altered when the muscle is disrupted. Here we describe a touch-evoked response and locomotion assay to examine swimming performance as a measure of muscle function.
Abstract
Zebrabärbling Muskelentwicklung ist mit Säugetiersystemen hoch konserviert sie ein hervorragendes Modell macht die Muskelfunktion und Krankheit zu untersuchen. Viele Myopathien der Skelettmuskelfunktion beeinträchtigen können schnell und einfach über die ersten paar Tage der Embryonalentwicklung in Zebrabärbling beurteilt werden. Mit dem 24 Stunden nach der Befruchtung (HPF), Wildtyp- Zebrabärbling Vertrag spontan ihre Schwanzmuskeln und um 48 HPF, Zebrabärbling Ausstellung kontrollierten Schwimmverhalten. Verringerung der Häufigkeit von oder andere Veränderungen in, können diese Bewegungen eine Skelettmuskelfunktionsstörung hinweisen. Um Schwimmverhalten zu analysieren und die Muskelleistung in frühen Zebrabärblingentwicklung beurteilen zu können, nutzen wir beide Touch-evozierte Fluchtreaktion und Lokomotion Assays.
Touch-evozierte Fluchtreaktion Assays können verwendet werden, um die Leistungsfähigkeit der Muskulatur während der kurzen Burst Bewegungen beurteilen aus Kontraktion der Fast-Twitch-Muskelfasern. Als Reaktion auf einen externen Stimulus, der in diesem Fall ein Antippender Kopf, Wildtyp- Zebrabärbling bei 2 Tage nach der Befruchtung (dpf) weisen typischerweise eine leistungsstarke Burst schwimmen, durch scharfe Kurven begleitet. Unsere Methode quantifiziert Skelettmuskelfunktion durch die maximale Beschleunigung während einer Burst-Schwimmbewegung zu messen, die Beschleunigung auf die Kraft direkt proportional durch Muskelkontraktion erzeugt.
Im Gegensatz dazu Lokomotion Tests während der frühen Zebrabärbling Larvenentwicklung verwendet werden, um die Leistungsfähigkeit der Muskulatur während anhaltender Perioden der Muskelaktivität zu bewerten. Verwendung eines Verfolgungssystems Schwimmverhalten zu überwachen, wurde eine automatisierte Berechnung der Häufigkeit der Anwendung und Entfernung in 6 Tage alten Zebrafisch, reflektierendes ihrer Skelettmuskelfunktion erhalten. Messungen der Schwimmleistung sind wertvoll für die phänotypischen Bewertung von Krankheitsmodellen und Hochdurchsatz-Screening von Mutationen oder chemischen Behandlungen Skelettmuskelfunktion zu beeinflussen.
Introduction
Während des letzten Jahrzehnts Zebrabärbling zunehmend verwendet worden, um Muskel Zellbiologie und der Krankheit zu untersuchen. Die rasche Entwicklung der externen Zebrafischembryo, gekoppelt mit seiner optischen Klarheit, ermöglicht die direkte Visualisierung der Muskelbildung, Wachstum und Funktion. Der Prozess der Entwicklung der Muskulatur ist stark in Zebrabärbling konserviert und dies hat die erfolgreiche Modellierung einer Reihe von Muskelerkrankungen einschließlich Muskeldystrophien und angeborenen Myopathien 1-8 erlaubt. Detaillierte Prüfung von Zebrabärbling Modelle hat nicht nur neue Einblicke in die Pathobiologie dieser Bedingungen zur Verfügung gestellt , sondern auch eine Plattform für die Erprobung geeigneter Therapien 6,9-13 zur Verfügung gestellt.
Die Analyse der Zebrabärbling Modelle von Muskelerkrankungen beruht auf zuverlässige und reproduzierbare Tests Muskelleistung zu messen. Frühere Studien haben erfolgreich die Krafterzeugungsfähigkeit des Zebrabärbling Rumpfmuskulatur in Fisch zwischen 3 und 7 dpf gemessenelektrisch stimulieren Kontraktion eines mit einem Kraftübertragungssystem 14 angebracht immobilisiert Fisch. Dies kann detaillierte Messungen von Kraft zur Verfügung stellen, sind jedoch nicht ideal für einen höheren Durchsatz Experimente geeignet und gibt es Vorteile für die Muskelleistung Messung während des Schwimmens. Bei 2 dpf Zebrabärbling Muskel ist voll funktionsfähig und die Fische können platzen Schwimmbewegungen als Reaktion auf Reize hervorzurufen. Die berührungs evozieren Fluchtreaktion-Assay wird verwendet, Beschleunigung zu messen, während eines Bursts Schwimmbewegung, die als Maß für die Kontraktionskraft verwendet werden kann.
Eines der am meisten verwendeten Maßnahmen der Muskelfunktion in Myopathie – Patienten ist die 6 min – Gehtest, die die Gesamtstrecke ging auf einer harten , flachen Oberfläche 15,16 aufzeichnet. Wir haben einen vergleichbaren Test zur Messung der Muskelfunktion in 6 dpf Zebrabärblingembryonen angewandt, wobei wir die gesamte Strecke geschwommen, und die Gesamtzahl der Bewegungen von jeder Larve über einen Zeitraum von 10 Minuten gemacht überwachen. Dies wird durchgeführt,unter Verwendung eines automatischen Verfolgungssystem, das zuverlässig und mit hoher Durchsatzmessungen von Muskelleistung liefert. Beide Muskeltests sind in hohem Maße reproduzierbar und verwendet wurden Unterschiede in der Muskelleistung in Zebrabärbling Myopathie Modelle 8 zu quantifizieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Viele verschiedene Tiermodelle einschließlich Mäuse, Hunde, Zebrabärbling, Fliegen und Würmer haben zu unserem Verständnis der genetischen und molekularen Grundlagen von Muskelerkrankungen beigetragen und bei der Entwicklung von therapeutischen Ansätzen unterstützt sie zu bekämpfen. Der Zebrafisch bietet mehrere Vorteile für die Untersuchung von Muskelerkrankungen. Der Zebrafisch ein genetisch manipulierbar System komplex Muskelmusterungs in einem geeigneten physiologischen Umgebung zu bewerten, die in in vitro Kultursystemen nicht möglich ist. Im Gegensatz zu anderen Wirbeltiermodellen erzeugt die große Anzahl von Fischen, zusammen mit seiner optischen Klarheit, erleichtert die schnelle Hochdurchsatz in vivo chemische und genetische Screening.
Hier beschreiben wir die Entwicklung von Zebrabärbling Bewegung Assays ein Hochdurchsatz und automatisierte Verfahren zu schaffen, Muskelleistung während Zebrabärbling Embryonalentwicklung zu beurteilen. Für beide Assays festzustellen, dass zirkadiane Rhythmen quittiert undexterne Reize aus der Umwelt deutlich Zebrabärbling Schwimmverhalten 17,18 beeinflussen. Wiederholtes Testen des gleichen Zebrabärbling wird auch Gewöhnung führen eine Abnahme der Reaktion auf den taktilen Reiz verursacht 23. Daher sollten, um reproduzierbare Ergebnisse zwischen den Experimenten jedes Zebrafischembryo zu erreichen nur einmal getestet werden, die Tageszeit und Lichtbedingungen standardisiert werden sollten, und die Wassertemperatur muss streng reguliert werden.
Mit dem Touch-evozierte Analyse bei 2 dpf wir direkt die maximale Beschleunigung eines Bursts Schwimmbewegungen messen können, die zu Muskelkraft proportional ist. Früheren Techniken in Zebrabärbling haben Muskelkraft untersucht , indem beide Enden der Embryonen zu Versuchsanlagen folgenden binden Kontraktion der Muskeln stimuliert wird unter Verwendung eines elektrischen Feldes und die Krafterzeugungsfähigkeit des Muskels 14 gemessen wird . Während dieses Verfahren misst die Kraft Kapazität von t Erzeugungser Larven Muskel, ist es nicht die tatsächliche Kraft messen durch die Larven Muskel erzeugt während des Schwimmens. Wir entwickelten deshalb ein Verfahren, um indirekt die Kraft beurteilen während des normalen Larvenschwimmbewegung erzeugt ein Gesamtmaß der Muskel Gesundheit zu liefern. Die Hochgeschwindigkeits-Videosystem, der fähig ist mit einer Bildrate von 1.000 Frames einzelnen Zebrabärbling Bewegungen Aufzeichnung / sec verwendet werden können kleine, aber signifikante Unterschiede in der Muskelfunktion, die nicht direkt durch unterscheidbare Auge zu identifizieren. Es wird interessant sein zu sehen, wie zuvor Änderungen berichtet in elektrisch stimulierte Kraft-Generation mit Veränderungen in der Schwimmleistung korrelieren.
Darüber hinaus evoziert die Touch – Reaktion Assays können auch eine quantitative Messung des Bewegungsverhaltens zu geben Schwimmkinematik, wie die Form und die Geschwindigkeit der Körperwelle während der Schwimmbewegung 24, zu beurteilen , verwendet werden.
Aufgrund der spontanen Bewegung zebrafish Larven nach 3 dpf, waren wir die berührungs evozieren Tests durchzuführen, um zu messen Muskelfunktion nicht in der Lage. Im Gegensatz dazu messen wir die Muskelleistung über einen längeren Zeitraum, indem der Abstand geschwommen von Zebrabärblingembryonen bei 6 dpf zu bestimmen. Dieser Test, obwohl ein indirektes Maß für die Muskelfunktion, kann verwendet werden , Fisch Anzeige beeinträchtigter Muskelleistung 8 oder Neurodegeneration 25,26 zu identifizieren. Dieser Test liefert nicht nur eine Messung analog zum 6 min – Gehtest , sondern eignet sich auch für die automatisierte Hochdurchsatz – in – vivo – Arzneimittel oder Mutagenese – Bildschirme.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Viewpoint for their kind sponsorship of this manuscript. This work was funded by an Australian National Health and Medical Research Council (NHMRC) Project Grant (APP1010110).
Materials
| 21G X 1' Blunt Needle | Terumo/Admiral Medical Supplies | TE2125 | |
| 48-well plates | Sigma | M8937 | |
| 90mm Petri Dishes | Pacific Laboratory Products PT | S90001 | |
| High Speed Camera | Baumer | HXC20 | |
| http://www.randomization.com | N/A | Steps 1.1.2, 2.1.3 | |
| Incubator | Thermoline Scientific | TEI-43L | |
| Plastic Pipette | VWR | 16001-188 | |
| StreamPix5 | NorPix | Step 1.2.3 | |
| Temperature Control Unit | Viewpoint | ||
| Tweezers, style 8 | ProSciTech | T04-821 | |
| Zebrabox System | Viewpoint | ||
| Zebralab | Viewpoint | Steps 1.3.1, 2.2.1 |
References
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