Utilisation de la réponse tactile évoqué et Locomotion essais pour évaluer la performance de la fonction musculaire et en Zebrafish
Summary
Zebrafish are an excellent model to study muscle function and disease. During early embryogenesis zebrafish begin regular muscle contractions producing rhythmic swimming behavior, which is altered when the muscle is disrupted. Here we describe a touch-evoked response and locomotion assay to examine swimming performance as a measure of muscle function.
Abstract
développement musculaire Zebrafish est hautement conservée avec les systèmes de mammifères qui les rend un excellent modèle pour étudier la fonction musculaire et de la maladie. Beaucoup de myopathies affectant la fonction des muscles squelettiques peuvent être rapidement et facilement évalués dans zebrafish au cours des premiers jours de l'embryogenèse. En 24 heures après la fécondation (HPF), de type sauvage zebrafish contracter spontanément leurs muscles de la queue et de 48 HPF, exposition contrôlée comportements de natation de poisson zèbre. Réduction de la fréquence, ou d'autres altérations, ces mouvements peuvent indiquer un dysfonctionnement du muscle squelettique. Pour analyser le comportement de natation et d'évaluer la performance musculaire dans le développement zebrafish tôt, nous utilisons les deux essais d'intervention et de locomotion échappement tactiles évoqués.
des essais de réponse échappement tactiles évoqués peuvent être utilisés pour évaluer la performance musculaire lors de courts mouvements d'éclatement résultant de la contraction des fibres musculaires à contraction rapide. En réponse à un stimulus externe, qui dans ce cas est un robinetla tête, de type sauvage zebrafish à 2 jours après la fécondation (dpf) présentent généralement un bain d'éclatement puissant, accompagné par des virages serrés. Notre procédé quantifie la fonction du muscle squelettique par la mesure de l'accélération maximale lors d'un mouvement de nage en rafale, l'accélération étant directement proportionnelle à la force produite par la contraction musculaire.
En revanche, les essais de locomotion au cours du développement larvaire zebrafish précoce sont utilisés pour évaluer la performance musculaire pendant les périodes prolongées de l'activité musculaire. En utilisant un système de suivi pour surveiller le comportement de nage, on obtient un calcul automatique de la fréquence de l'activité et la distance en six jours vieux poisson zèbre, le reflet de leur fonction musculaire squelettique. Les mesures de la performance de nage sont utiles pour l'évaluation phénotypique des modèles de maladies et de criblage à haut débit de mutations ou de traitements chimiques qui affectent la fonction du muscle squelettique.
Introduction
Au cours de la dernière décennie zebrafish ont été de plus en plus utilisée pour étudier les muscles de la biologie cellulaire et de la maladie. Le développement rapide externe de l'embryon de poisson zèbre, couplé à sa clarté optique, permet la visualisation directe de la formation des muscles, la croissance et la fonction. Le processus de développement musculaire est fortement conservée chez le poisson zèbre et cela a permis à la modélisation réussie d'une série de maladies musculaires , y compris les dystrophies musculaires et myopathies congénitales 1-8. L' examen détaillé des modèles de poisson zèbre a non seulement fourni des informations nouvelles dans la physiopathologie de ces conditions , mais aussi fourni une plate – forme pour les essais de thérapies appropriées 6,9-13.
L'analyse des modèles de maladies de poisson zèbre musculaires repose sur des analyses fiables et reproductibles pour mesurer la performance musculaire. Des études antérieures ont réussi à mesurer la capacité de génération de force du muscle du tronc zebrafish dans le poisson entre 3 et 7 DPF parstimuler électriquement la contraction d'un poisson immobilisé relié à un système force de transduction 14. Cela peut fournir des mesures détaillées de la force, mais ne sont pas parfaitement adapté à des expériences de débit plus élevé et il y a des avantages à la mesure de la performance musculaire au cours de natation. A 2 dpf musculaire zebrafish est entièrement fonctionnel et les poissons peuvent provoquer des mouvements de natation de rafale en réponse à des stimuli. Le dosage de la réponse tactile échappement évoquer est utilisé pour mesurer l'accélération lors d'un mouvement de nage en rafale, qui peut être utilisé comme une mesure de la force contractile.
L' une des mesures les plus utilisées de la fonction musculaire chez les patients atteints de myopathie est le test de marche de 6 minutes, qui enregistre la distance totale parcourue sur une surface plane et dure 15,16. Nous avons appliqué un test comparable pour mesurer la fonction musculaire dans 6 dpf larves de poisson zèbre, par lequel nous surveillons la distance totale nagé, et le nombre total de mouvements effectués par chaque larve sur une période de 10 min. Cette opération est effectuéeen utilisant un système de suivi automatisé, qui fournit des mesures fiables et à haut débit de la performance musculaire. Les deux essais musculaires sont hautement reproductibles et ont été utilisés pour quantifier les différences dans la performance musculaire dans les modèles 8 myopathie de poisson zèbre.
Protocol
Representative Results
Discussion
Beaucoup de différents modèles animaux, y compris les souris, les chiens, le poisson zèbre, les mouches et les vers ont contribué à notre compréhension de la base génétique et moléculaire des maladies musculaires, et a contribué à l'élaboration d'approches thérapeutiques pour les combattre. Le zebrafish dispose de plusieurs avantages pour l'étude des maladies musculaires. Le poisson zèbre fournit un système génétiquement manipulé pour évaluer patterning musculaire complexe dans un environnement physiologique approprié, ce qui est impossible dans les systèmes de culture in vitro. Contrairement à d' autres modèles animaux vertébrés, le grand nombre de poissons produits, ainsi que sa clarté optique, facilite rapide, à haut débit dans l' industrie chimique vivo et le dépistage génétique.
Nous décrivons ici le développement de tests de mouvement de poisson zèbre pour fournir un haut débit et méthode automatisée pour évaluer la performance musculaire pendant l'embryogenèse zebrafish. Pour les deux essais, il faut reconnaître que les rythmes circadiens etstimuli environnementaux externes affectent considérablement le comportement de natation zebrafish 17,18. Des tests répétés du même zebrafish conduira également à habituation provoquant une diminution de la réponse au stimulus tactile 23. Par conséquent, afin d'obtenir des résultats reproductibles entre les expériences de chaque embryon de poisson zèbre ne devrait être testé une fois, le temps des conditions de jour et l'éclairage devrait être normalisée, et la température de l'eau doit être strictement réglementée.
Utilisation de la touche a évoqué l'analyse à 2 dpf nous pouvons mesurer directement l'accélération maximale d'une action de nage en rafale, qui est proportionnelle à la force musculaire. Les techniques précédentes en zebrafish ont examiné la force musculaire en liant les deux extrémités des embryons à des équipements expérimentaux suivants qui contraction musculaire est stimulée en utilisant un champ électrique et la capacité de génération de force du muscle 14 est mesurée. Alors que cette méthode permet de mesurer la force de capacité de production de til muscle larvaire, il ne mesure pas la force réelle générée par le muscle larvaire au cours de natation. Nous avons donc développé une méthode pour évaluer indirectement la force générée pendant le mouvement de la natation larvaire normale pour fournir une mesure globale de la santé des muscles. Le système de vidéo à haute vitesse, capable d'enregistrer les mouvements individuels de poisson zèbre à un taux de 1.000 images de trame / sec peut être utilisé pour identifier les petites mais significatives différences dans la fonction musculaire, qui ne sont pas directement distinguer à l'oeil nu. Il sera intéressant de voir comment précédemment rapporté des changements dans stimulée électriquement de génération de forces corrélation avec l'évolution des performances de la natation.
En outre , le contact a évoqué des tests de réponse peuvent également être utilisés pour évaluer la cinématique de natation, tels que la forme et la vitesse de l'onde du corps pendant le mouvement de natation 24, pour donner une mesure quantitative du comportement locomoteur.
En raison du mouvement spontané de zebraflarves ish après 3 dpf, nous n'étions pas en mesure d'effectuer les tests tactiles évoquent pour mesurer la fonction musculaire. A l'inverse, nous avons mesuré la performance musculaire sur une période plus longue en déterminant la nage à distance par les larves de poisson zèbre à 6 dpf. Ce test, bien que d' une mesure indirecte de la fonction musculaire, peut être utilisé pour identifier des poissons présentant des performances musculaires avec facultés affaiblies 8 ou neurodégénérescence 25,26. Ce test fournit non seulement une mesure analogue au test de marche de 6 minutes , mais est également adapté pour à haut débit automatisé dans les écrans de drogue ou mutagenèse in vivo.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Viewpoint for their kind sponsorship of this manuscript. This work was funded by an Australian National Health and Medical Research Council (NHMRC) Project Grant (APP1010110).
Materials
| 21G X 1' Blunt Needle | Terumo/Admiral Medical Supplies | TE2125 | |
| 48-well plates | Sigma | M8937 | |
| 90mm Petri Dishes | Pacific Laboratory Products PT | S90001 | |
| High Speed Camera | Baumer | HXC20 | |
| http://www.randomization.com | N/A | Steps 1.1.2, 2.1.3 | |
| Incubator | Thermoline Scientific | TEI-43L | |
| Plastic Pipette | VWR | 16001-188 | |
| StreamPix5 | NorPix | Step 1.2.3 | |
| Temperature Control Unit | Viewpoint | ||
| Tweezers, style 8 | ProSciTech | T04-821 | |
| Zebrabox System | Viewpoint | ||
| Zebralab | Viewpoint | Steps 1.3.1, 2.2.1 |
References
- Bassett, D. I., Bryson-Richardson, R. J., Daggett, D. F., Gautier, P., Keenan, D. G., Currie, P. D. Dystrophin is required for the formation of stable muscle attachments in the zebrafish embryo. Development. 130 (23), 5851-5860 (2003).
- Gupta, V. A., Kawahara, G., et al. A splice site mutation in laminin-α2 results in a severe muscular dystrophy and growth abnormalities in zebrafish. PLoS ONE. 7 (8), e43794 (2012).
- Gupta, V., Kawahara, G., et al. The zebrafish dag1 mutant: a novel genetic model for dystroglycanopathies. Hum Mol Genet. 20 (9), 1712-1725 (2011).
- Kawahara, G., Karpf, J. A., Myers, J. A., Alexander, M. S., Guyon, J. R., Kunkel, L. M. Drug screening in a zebrafish model of Duchenne muscular dystrophy. Proc Natl Acad Sci. 108 (13), 5331-5336 (2011).
- Telfer, W. R., Nelson, D. D., Waugh, T., Brooks, S. V., Dowling, J. J. neb: a zebrafish model of nemaline myopathy due to nebulin mutation. Dis Model & Mech. 5 (3), 389-396 (2012).
- Ruparelia, A. A., Oorschot, V., Vaz, R., Ramm, G., Bryson-Richardson, R. J. Zebrafish models of BAG3 myofibrillar myopathy suggest a toxic gain of function leading to BAG3 insufficiency. Acta Neuropathol. 128 (6), 821-833 (2014).
- Sztal, T. E., Sonntag, C., Hall, T. E., Currie, P. D. Epistatic dissection of laminin-receptor interactions in dystrophic zebrafish muscle. Hum Mol Genet. 21 (21), 4718-4731 (2012).
- Sztal, T. E., Zhao, M., et al. Zebrafish models for nemaline myopathy reveal a spectrum of nemaline bodies contributing to reduced muscle function. Acta Neuropathol. 130 (3), 389-406 (2015).
- Pichler, F. B., Laurenson, S., Williams, L. C., Dodd, A., Copp, B. R., Love, D. R. Chemical discovery and global gene expression analysis in zebrafish. Nat Biotechnol. 21 (8), 879-883 (2003).
- Peterson, R. T., Shaw, S. Y., et al. Chemical suppression of a genetic mutation in a zebrafish model of aortic coarctation. Nat Biotechnol. 22 (5), 595-599 (2004).
- Kawahara, G., Serafini, P. R., Myers, J. A., Alexander, M. S., Kunkel, L. M. Characterization of zebrafish dysferlin by morpholino knockdown. Biochem Bioph Res Co. 413 (2), 358-363 (2011).
- Zon, L. I., Peterson, R. T. In vivo drug discovery in the zebrafish. Nat Rev Drug Discov. , (2005).
- Smith, L. L., Beggs, A. H., Gupta, V. A. Analysis of skeletal muscle defects in larval zebrafish by birefringence and touch-evoke escape response assays. J Vis Exp. (82), e50925 (2013).
- Sloboda, D. D., Claflin, D. R., Dowling, J. J., Brooks, S. V. Force measurement during contraction to assess muscle function in zebrafish larvae. J Vis Exp. (77), (2013).
- McDonald, C. M., Henricson, E. K., et al. The 6-minute walk test as a new outcome measure in Duchenne muscular dystrophy. Muscle Nerve. 41 (4), 500-510 (2010).
- McDonald, C. M., Henricson, E. K., et al. The 6-minute walk test and other clinical endpoints in duchenne muscular dystrophy: reliability, concurrent validity, and minimal clinically important differences from a multicenter study. Muscle Nerve. 48 (3), 357-368 (2013).
- Hurd, M. W., Debruyne, J., Straume, M., Cahill, G. M. Circadian rhythms of locomotor activity in zebrafish. Physiol Behav. 65 (3), 465-472 (1998).
- MacPhail, R. C., Brooks, J., Hunter, D. L., Padnos, B., Irons, T. D., Padilla, S. Locomotion in larval zebrafish: Influence of time of day, lighting and ethanol. Neurotoxicology. 30 (1), 52-58 (2009).
- Berger, J., Berger, S., Jacoby, A. S., Wilton, S. D., Currie, P. D. Evaluation of exon-skipping strategies for Duchenne muscular dystrophy utilizing dystrophin-deficient zebrafish. J Cell Mol Med. 15 (12), 2643-2651 (2011).
- Berger, J., Sztal, T., Currie, P. D. Quantification of birefringence readily measures the level of muscle damage in zebrafish. Biochem Bioph Res Co. 423 (4), 785-788 (2012).
- Ravenscroft, G., Jackaman, C., et al. Mouse models of dominant ACTA1 disease recapitulate human disease and provide insight into therapies. Brain. 134 (4), 1101-1115 (2011).
- Ravenscroft, G., Wilmshurst, J. M., et al. A novel ACTA1 mutation resulting in a severe congenital myopathy with nemaline bodies, intranuclear rods and type I fibre predominance. Neuromuscular Disord. 21 (1), 31-36 (2011).
- Wolman, M. A., Jain, R. A., Liss, L., Granato, M. Chemical modulation of memory formation in larval zebrafish. Proc Natl Acad Sci. 108 (37), 15468-15473 (2011).
- Müller, U. K., van Leeuwen, J. L. Swimming of larval zebrafish: ontogeny of body waves and implications for locomotory development. J Exp Biol. 207 (Pt 5), 853-868 (2004).
- Cheng, W., Tian, J., Burgunder, J. M., Hunziker, W., Eng, H. L. Myotonia congenita-associated mutations in chloride channel-1 affect zebrafish body wave swimming kinematics. PLoS ONE. 9 (8), e103445 (2014).
- Moggio, M., Colombo, I., et al. Mitochondrial disease heterogeneity: a prognostic challenge. Acta Myol. 33 (2), 86-93 (2014).
