Determinação das espécies e quantificação de misturas utilizando MRM Espectrometria de Massa de peptídeos Aplicada à autenticação Meat
Summary
We present a protocol for identifying and quantifying the components in mixtures of species possessing similar proteins. Mass spectrometry detects peptides for identification, and gives relative quantitation by ratios of peak areas. As a tool food for fraud detection, the method can detect 1% horse in beef.
Abstract
We describe a simple protocol for identifying and quantifying the two components in binary mixtures of species possessing one or more similar proteins. Central to the method is the identification of ‘corresponding proteins’ in the species of interest, in other words proteins that are nominally the same but possess species-specific sequence differences. When subject to proteolysis, corresponding proteins will give rise to some peptides which are likewise similar but with species-specific variants. These are ‘corresponding peptides’. Species-specific peptides can be used as markers for species determination, while pairs of corresponding peptides permit relative quantitation of two species in a mixture. The peptides are detected using multiple reaction monitoring (MRM) mass spectrometry, a highly specific technique that enables peptide-based species determination even in complex systems. In addition, the ratio of MRM peak areas deriving from corresponding peptides supports relative quantitation. Since corresponding proteins and peptides will, in the main, behave similarly in both processing and in experimental extraction and sample preparation, the relative quantitation should remain comparatively robust. In addition, this approach does not need the standards and calibrations required by absolute quantitation methods. The protocol is described in the context of red meats, which have convenient corresponding proteins in the form of their respective myoglobins. This application is relevant to food fraud detection: the method can detect 1% weight for weight of horse meat in beef. The corresponding protein, corresponding peptide (CPCP) relative quantitation using MRM peak area ratios gives good estimates of the weight for weight composition of a horse plus beef mixture.
Introduction
The European horse meat scandal of 2013, in which undeclared horse meat was found in a number of supermarket beef products1, highlights the need for testing methods capable of detecting and measuring food fraud in meat. Several technologies have been explored, especially enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and DNA-based methods2. An alternative route, based on mass spectrometry, targets species-specific peptides which in turn arise from species-specific proteins. Here we outline one such peptide-based approach that offers both identification and relative quantitation of the adulterant species in a meat mixture3.
The protocol is framed in the context of red meats and the desire to determine the presence of one in another at the level of 1% by weight, the level considered by some to represent fraudulent food adulteration as opposed to contamination4. The method relies in the first instance on identifying a protein which is nominally ‘the same’ in all target meats. Myoglobin, the protein responsible for the red color of meat, is a good candidate since it is abundant, relatively heat tolerant and water soluble, and has been used for species determination of meat previously5,6. The myoglobins for beef (Bos Taurus), pork (Sus scrofa), horse (Equus caballus) and lamb (Ovis aries)3, for instance, are nominally the same, as required, but their sequences are not identical. Such groups of ‘similar but different’ proteins, like these four myoglobins, can conveniently be described as ‘corresponding proteins’. The sequence differences in these four myoglobins are species-specific: for example, the full myoglobin proteins for beef and horse, P02192 and P68082 respectively, each comprise 154 amino acids with 18 sequence differences between the two. Subject to proteolysis using trypsin these proteins produce two sets of peptides, some of which are identical, and some which show one or more species-specific amino acid differences: corresponding proteins therefore give rise to corresponding peptides.
The CPCP approach, therefore, seeks first to identify proteins from two or more species where these proteins exhibit limited species-specific sequence variants. These are corresponding proteins. Following proteolysis, corresponding proteins give rise to peptides, some of which likewise display species-specific sequence variants inherited from the parent protein. These are corresponding peptides. The CPCP approach can be used to compare levels of two corresponding proteins in a mixed species sample by monitoring the levels of corresponding peptides.
The natural technology for the detection of known peptides is multiple reaction monitoring mass spectrometry, or MRM-MS7. Species-specific peptides yield precursor ions, which along with their mass spectrometry fragment ions, are easily itemized in advance by software tools. These lists are then used to instruct the mass spectrometer to record only specific precursor plus fragment ion pairs, called transitions. A particular target peptide is therefore identified not only by its retention time in the chromatography preceding the mass spectrometer, but also by a set of transitions sharing a common precursor ion. This is a highly selective means of detecting known peptides that makes efficient use of the mass spectrometer resource.
Other authors have used mass spectrometry to test for meat adulteration via peptide markers but from disparate proteins8-14. Using the corresponding proteins, corresponding peptides (CPCP) scheme, however, means experimental conditions can be optimized, aiding identification of the species in the mixture from known species-specific transitions. In addition, corresponding proteins and peptides will generally behave similarly in the extraction, proteolysis and detection stages. Since transition peak areas are quantitative and reproducible, ratios of peak areas arising from pairs of corresponding peptides from different species provide a direct estimate of the relative quantities of two meats in a mixture. In contrast, more traditional quantitation routes exploit calibrations based on reference materials to establish absolute quantitation14,15.
Though the protocol is outlined in the context of myoglobin and meat, proteins other than myoglobin could be used for identification and relative quantitation via the CPCP strategy in meat mixtures, though potentially with modifications to the protocol. In addition the strategy is also applicable to binary mixtures of other species sharing one or more corresponding proteins.
The starting point for the protocol is purified ‘reference’ myoglobin, which for some species can be purchased but which for others must be prepared by conventional size-exclusion chromatography. The procedure for preparing reference myoglobin is not included in the protocol, but is described elsewhere3. Software tools16 are used to list candidate peptides and transitions arising from myoglobins of interest. Each reference myoglobin is subjected to proteolysis and the resultant peptides analyzed by liquid chromatography electrospray ionization tandem mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS) to discover which of the candidate precursor ions and transitions are most useful, and to determine the matching peptide retention times. The outcome of this stage is a revised list of target peptides with their transitions, suitable for species determination, and a list of CPCP pairs, suitable for relative quantitation. To test real meats, sample extractions are prepared then subjected to proteolysis to generate peptides both from myoglobin and other extraneous proteins. The myoglobin-based peptides are then monitored by LC-ESI-MS/MS based on their listed transitions. The species present in a mixture are identified by the transition peaks associated with marker peptides. Estimates of the relative amounts of two meats in a binary mixture are calculated using ratios of transition peak areas. A set of test mixtures of pairs of meats will allow the ratio of peak areas for a given pair of transitions to be checked and calibrated against actual mixtures.
Protocol
Representative Results
Discussion
A selecção de uma proteína alvo adequado é importante. Uma boa proteína alvo precisa ter formas correspondentes em espécies de interesse, suficiente variação de sequência dependente da espécie, especificidade das espécies, e existem em quantidades acessíveis dentro dos organismos. Para avaliar a misturas que tenham sido submetidas a tratamento (por exemplo, tratamento de calor), uma proteína que tem uma sequência relativamente imune a que o processamento é desejável. A mioglobina é um bom candidato para carnes vermelhas, incluindo carnes vermelhas cozidas, mas não é a única possibilidade. Uma vez que a proteína alvo é decidido, a parte mais crítica do protocolo é a proteólise da proteína. Uma proteína diferente da mioglobina pode também exigir um protocolo de proteólise alternativa.
O protocolo como descrito inclui um segmento com base em proteína de referência purificado. O objectivo é descobrir janelas de tempo de retenção e íons precursores e fragmento adequados. Este segmento é muito útil, mas não essencial.
<pclass = "jove_content"> Apesar de pares de peptídeos correspondentes de duas espécies de interesse podem ser listados, mesmo sem experiência, às vezes é o caso que uma diferença sequência tem consequências dramáticas para o perfil de digestão. Por exemplo, o par de péptido VLGFHG (carne) e ELGFQG (cavalo) dá um resultado anómalo quantificação (manifestam-se como uma inclinação inferior a um na Figura 2). Isto é porque este péptido resulta de uma clivagem KE relativamente suprimida, fazendo uma sub-estimativa do nível de cavalo na mistura. péptidos de partida correspondente com aminoácidos diferentes são, por conseguinte, melhor evitado. Muitas vezes, os fragmentos a partir de dois péptidos correspondentes têm sequências de aminoácidos idênticas e são bem comportado, mas este não é sempre o caso, e necessita de ser verificada durante o desenvolvimento do método. A identificação das espécies é muito menos sensível a estas questões do que quantificação relativa.O protocolo foi demonstrada durante quatro carne vermelhas 3. espécies de carne adicionais podem ser incluídos, embora a qualidade da forma do pico de transição pode deteriorar-se muitos péptidos marcadores co-eluir, reduzindo eficazmente o tempo de permanência e, finalmente, degradando estimativas quantificação relativa. A instrumentação, já disponível, vai melhorar isso. Um problema relacionado é que nem todas as carnes têm diferentes myoglobins. Por exemplo, cavalo, burro e myoglobins zebra são idênticos e, portanto, estritamente falando, o método só é capaz de detectar a cavalo ou de burro ou zebra na carne de bovino. Em alguns casos, mesmo que mioglobinas não são idênticos, alguns péptidos-chave pode ser. Por exemplo, alguns péptidos marcadores derivados de mioglobina de cordeiro também aparecem na cabra.
Uma complicação de frente para este e qualquer outro método de quantificação baseado em proteínas é que o nível de proteína deve ser assumida constante para todas as espécies, se os níveis de proteínas ou péptidos são trivialmente a igualar a níveis de carnes em uma mistura. Para a mioglobina e quatro m vermelhocome isso não é uma verdade universal. Os níveis em geral, são espécies dependentes, com carne de porco que exibem o nível mais baixo dos quatro. Além disso, o nível de mioglobina varia com carne cortada e idade dos animais. Assim, embora proporções de áreas de pico de transição mapear de forma confiável para os rácios de mioglobina, o mapeamento a proporção de carnes reais é um desenho estimativa sobre os pressupostos relativos aos prováveis fontes de carnes na mistura.
A abordagem descrita neste trabalho difere em um número de maneiras de outras contribuições publicadas. Uma via mais típico é a utilização de métodos de proteómica para identificar vários péptidos marcadores dependente de espécies diferentes, caso em que os marcadores de espécies diferentes possuem nenhuma relação particular com um outro 8-12,14,19. Por outro lado, nós selecionamos proteínas comuns a todas as espécies de interesse até espécies dependentes de sequência de variantes 3. Para além de ser essencial para a nossa estratégia quantificação relativa, isto tem a vantagem que a amostraestratégias de preparação pode ser optimizada. Além disso, essas proteínas correspondentes pode ser esperado comportar-se de forma semelhante, por exemplo, na extracção ou no processamento comercial de amostras, tais como cozinhar ou conservas. A identificação das espécies, então, normalmente procede através da detecção de peptídeos marcadores diferentes, enquanto que nos abordagem CPCP identificação de espécies procede via detecção de peptídeos estreitamente relacionados que possuem normalmente um ou dois diferenças de sequência. Finalmente, a quantificação de proteínas para calcular a percentagem em peso de uma espécie na outra pode prosseguir através convencionalmente quantificação absoluta de cada proteína baseada separadamente em padrões conhecidos 7,14,15. No entanto, utilizando o método de CPCP não há necessidade de métodos de calibração. Em vez disso, os níveis relativos são estimados através da comparação de intensidades de sinal de dois péptidos correspondentes a partir das duas espécies, contornando a fase de medição absoluta no seu conjunto. Uma vez que o objetivo final é uma percentagem em peso de uma espécie em another, uma quantificação relativa, então o CPCP é tanto mais direta e mais simples do que comparar duas medidas quantificação absoluta. Estas características traduzem em tempos experimentais curtos, previstos para ser cerca de duas horas usando protocolos refinados, tornando a técnica útil como uma ferramenta de vigilância rápida no campo da detecção de fraudes alimentos.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We acknowledge financial support from Institute of Food research BBSRC Core Strategic Grant funds, BBSRC Project BB/J004545/1.
Materials
| Uniprot database | www.uniprot.org | Freely accessible database of protein sequences | |
| Skyline software | www.skyline.gs.washington.edu | Free software to download that enables the creation of targeted methods for proteomic studies, peptide and fragment prediction | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich Co Ltd, Gillingham, UK www.sigmaaldrich.com | O9830 | |
| Methanol, HPLC grade | Fisher Scientific, Loughoborough, UK www. fisher.co.uk | 10674922 | |
| Acetonitrile, HPLC grade | Fisher Scientific, Loughoborough, UK www. fisher.co.uk | 10010010 | |
| Urea | Sigma-Aldrich Co Ltd, Gillingham, UK www.sigmaaldrich.com | U5378 | |
| Trypsin(from bovine pancreas treated with TPCK) | Sigma-Aldrich Co Ltd, Gillingham, UK www.sigmaaldrich.com | T1426 | |
| Formic acid | Sigma-Aldrich Co Ltd, Gillingham, UK www.sigmaaldrich.com | F0507 | |
| Coomassie Plus Protein Assay Reagent | Thermo Fisher Scientific www.thermofisher.com | 1856210 | |
| Protein standard | Sigma-Aldrich Co Ltd, Gillingham, UK www.sigmaaldrich.com | P0914 | |
| Ultra Turrax homogeniser T25 | Fisher Scientific, Loughoborough, UK www. fisher.co.uk | 13190693 | |
| Edmund and Buhler KS10 lab shaker | |||
| Heraeus Fresco 17 Centrifuge | Thermo Fisher Scientific www.thermoscientific.com | 75002420 | |
| Vacuum centrifuge RC 1022 | Jouan | ||
| Plate Reader | |||
| Strata-X 33u polymeric reversed-phase cartridges 60 mg/3 ml tubes | Phenomenex, Macclesfield, UK | 8B-S100-UBJ | |
| 4000 QTrap triple-quadrupole mass spectrometer | AB Sciex, Warrington, UK www.sciex.com | ||
| 1200 rapid resolution LC system | Agilent, Stockport, UK | ||
| XB C18 reversed-phase capillary column (100 x 2.1mm, 2.6µ particle size) | Phenomenex, Macclesfield, UK www.phenomenex.com | ||
| Analyst 1.6.2 software | AB Sciex, Warrington, UK www.sciex.com | QTrap data acquisition and analysis, including peak area integration | |
| Autosampler vials |
References
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