Artbestimmung und Quantifizierung in Mischungen Mit MRM-Massenspektrometrie von Peptiden, der Fleisch-Authentifizierung
Summary
We present a protocol for identifying and quantifying the components in mixtures of species possessing similar proteins. Mass spectrometry detects peptides for identification, and gives relative quantitation by ratios of peak areas. As a tool food for fraud detection, the method can detect 1% horse in beef.
Abstract
We describe a simple protocol for identifying and quantifying the two components in binary mixtures of species possessing one or more similar proteins. Central to the method is the identification of ‘corresponding proteins’ in the species of interest, in other words proteins that are nominally the same but possess species-specific sequence differences. When subject to proteolysis, corresponding proteins will give rise to some peptides which are likewise similar but with species-specific variants. These are ‘corresponding peptides’. Species-specific peptides can be used as markers for species determination, while pairs of corresponding peptides permit relative quantitation of two species in a mixture. The peptides are detected using multiple reaction monitoring (MRM) mass spectrometry, a highly specific technique that enables peptide-based species determination even in complex systems. In addition, the ratio of MRM peak areas deriving from corresponding peptides supports relative quantitation. Since corresponding proteins and peptides will, in the main, behave similarly in both processing and in experimental extraction and sample preparation, the relative quantitation should remain comparatively robust. In addition, this approach does not need the standards and calibrations required by absolute quantitation methods. The protocol is described in the context of red meats, which have convenient corresponding proteins in the form of their respective myoglobins. This application is relevant to food fraud detection: the method can detect 1% weight for weight of horse meat in beef. The corresponding protein, corresponding peptide (CPCP) relative quantitation using MRM peak area ratios gives good estimates of the weight for weight composition of a horse plus beef mixture.
Introduction
The European horse meat scandal of 2013, in which undeclared horse meat was found in a number of supermarket beef products1, highlights the need for testing methods capable of detecting and measuring food fraud in meat. Several technologies have been explored, especially enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and DNA-based methods2. An alternative route, based on mass spectrometry, targets species-specific peptides which in turn arise from species-specific proteins. Here we outline one such peptide-based approach that offers both identification and relative quantitation of the adulterant species in a meat mixture3.
The protocol is framed in the context of red meats and the desire to determine the presence of one in another at the level of 1% by weight, the level considered by some to represent fraudulent food adulteration as opposed to contamination4. The method relies in the first instance on identifying a protein which is nominally ‘the same’ in all target meats. Myoglobin, the protein responsible for the red color of meat, is a good candidate since it is abundant, relatively heat tolerant and water soluble, and has been used for species determination of meat previously5,6. The myoglobins for beef (Bos Taurus), pork (Sus scrofa), horse (Equus caballus) and lamb (Ovis aries)3, for instance, are nominally the same, as required, but their sequences are not identical. Such groups of ‘similar but different’ proteins, like these four myoglobins, can conveniently be described as ‘corresponding proteins’. The sequence differences in these four myoglobins are species-specific: for example, the full myoglobin proteins for beef and horse, P02192 and P68082 respectively, each comprise 154 amino acids with 18 sequence differences between the two. Subject to proteolysis using trypsin these proteins produce two sets of peptides, some of which are identical, and some which show one or more species-specific amino acid differences: corresponding proteins therefore give rise to corresponding peptides.
The CPCP approach, therefore, seeks first to identify proteins from two or more species where these proteins exhibit limited species-specific sequence variants. These are corresponding proteins. Following proteolysis, corresponding proteins give rise to peptides, some of which likewise display species-specific sequence variants inherited from the parent protein. These are corresponding peptides. The CPCP approach can be used to compare levels of two corresponding proteins in a mixed species sample by monitoring the levels of corresponding peptides.
The natural technology for the detection of known peptides is multiple reaction monitoring mass spectrometry, or MRM-MS7. Species-specific peptides yield precursor ions, which along with their mass spectrometry fragment ions, are easily itemized in advance by software tools. These lists are then used to instruct the mass spectrometer to record only specific precursor plus fragment ion pairs, called transitions. A particular target peptide is therefore identified not only by its retention time in the chromatography preceding the mass spectrometer, but also by a set of transitions sharing a common precursor ion. This is a highly selective means of detecting known peptides that makes efficient use of the mass spectrometer resource.
Other authors have used mass spectrometry to test for meat adulteration via peptide markers but from disparate proteins8-14. Using the corresponding proteins, corresponding peptides (CPCP) scheme, however, means experimental conditions can be optimized, aiding identification of the species in the mixture from known species-specific transitions. In addition, corresponding proteins and peptides will generally behave similarly in the extraction, proteolysis and detection stages. Since transition peak areas are quantitative and reproducible, ratios of peak areas arising from pairs of corresponding peptides from different species provide a direct estimate of the relative quantities of two meats in a mixture. In contrast, more traditional quantitation routes exploit calibrations based on reference materials to establish absolute quantitation14,15.
Though the protocol is outlined in the context of myoglobin and meat, proteins other than myoglobin could be used for identification and relative quantitation via the CPCP strategy in meat mixtures, though potentially with modifications to the protocol. In addition the strategy is also applicable to binary mixtures of other species sharing one or more corresponding proteins.
The starting point for the protocol is purified ‘reference’ myoglobin, which for some species can be purchased but which for others must be prepared by conventional size-exclusion chromatography. The procedure for preparing reference myoglobin is not included in the protocol, but is described elsewhere3. Software tools16 are used to list candidate peptides and transitions arising from myoglobins of interest. Each reference myoglobin is subjected to proteolysis and the resultant peptides analyzed by liquid chromatography electrospray ionization tandem mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS) to discover which of the candidate precursor ions and transitions are most useful, and to determine the matching peptide retention times. The outcome of this stage is a revised list of target peptides with their transitions, suitable for species determination, and a list of CPCP pairs, suitable for relative quantitation. To test real meats, sample extractions are prepared then subjected to proteolysis to generate peptides both from myoglobin and other extraneous proteins. The myoglobin-based peptides are then monitored by LC-ESI-MS/MS based on their listed transitions. The species present in a mixture are identified by the transition peaks associated with marker peptides. Estimates of the relative amounts of two meats in a binary mixture are calculated using ratios of transition peak areas. A set of test mixtures of pairs of meats will allow the ratio of peak areas for a given pair of transitions to be checked and calibrated against actual mixtures.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Auswahl eines geeigneten Zielproteins ist wichtig. Ein gutes Zielprotein muss entsprechende Formen in Spezies von Interesse, ausreichend artspezifische Sequenzvariation, Artenspezifizität und existieren in zugänglichen Mengen innerhalb der Organismen haben. Zur Beurteilung der Mischungen, die verarbeitet worden sind (beispielsweise Wärmebehandlung), ein Protein mit einer Sequenz relativ immun gegenüber diesem Verarbeitung aufweist, ist wünschenswert. Myoglobin ist ein guter Kandidat für rotes Fleisch, einschließlich gekocht rotem Fleisch, ist aber nicht die einzige Möglichkeit. Sobald das Zielprotein entschieden wird, ist der kritischste Teil des Protokolls das Protein Proteolyse. Ein Protein unterscheidet sich von Myoglobin kann auch ein alternatives Proteolyse Protokoll verlangen.
Das Protokoll enthält basierend auf Referenz gereinigtes Protein ein Segment beschrieben. Diese zielt darauf ab, Retentionszeitfenster und geeignete Vorstufe und Fragmentionen entdecken. Dieses Segment ist sehr hilfreich, aber nicht unbedingt erforderlich.
<pclass = "jove_content"> Obwohl entsprechenden Peptidpaare von zwei Spezies von Interesse auch ohne Experiment aufgeführt werden können, ist es manchmal der Fall, dass eine Sequenzunterschied dramatische Auswirkungen auf die Verdauungsprofil aufweist. Zum Beispiel kann das Peptid Paar VLGFHG (Rind) und ELGFQG (Pferd) geben eine anomale Quantifizierung Ergebnis (Manifest als Steigung weniger als ein in Abbildung 2). Dies ist, weil das letztere Peptid aus einem relativ unterdrückt KE Spaltung entsteht, in dem Gemisch eine Unterschätzung des Pegels des Pferdes verursacht. Entsprechende Peptide mit verschiedenen Aminosäuren beginnen, werden deshalb am besten vermieden werden. Oft werden die Fragmente aus zwei entsprechenden Peptide haben identische Aminosäuresequenzen und sind gut erzogene, aber dies ist nicht immer der Fall und muss während der Verfahrensentwicklung überprüft werden. Spezies Identifizierung ist viel weniger empfindlich auf diese Fragen als relativen Quantifizierung.Das Protokoll wurde für vier rotes Fleisch nachgewiesens 3. Zusätzliche Fleischarten können eingeschlossen werden, obwohl die Qualität des Übergangs Peakform verschlechtern kann, wenn zu viele Markerpeptide koeluieren, effektiv die Verweilzeit reduziert und schließlich relativen Quantifizierung Schätzungen zu verschlechtern. Verbesserte Instrumentierung, bereits vorhanden, wird dies zu verbessern. Ein ähnliches Problem ist, dass nicht alle Fleisch unterschiedliche Myoglobinen haben. Zum Beispiel, Pferd, Esel und Zebra Myoglobinen identisch sind und somit das Verfahren streng genommen ist nur in der Lage Pferd oder Esel oder Zebras in Rindfleisch zu erkennen. In einigen Fällen, obwohl Myoglobine nicht identisch sind, können einige der wichtigsten Peptide sein. Zum Beispiel werden einige Lamm Myoglobin-derived Markerpeptide auch in Ziege.
Eine Komplikation mit Blick auf diese und andere Protein-basierte Quantifizierungsmethode ist, dass die Protein-Ebene in allen Spezies konstant angenommen werden muss, wenn das Protein oder Peptidspiegel trivialer auf ein Niveau von Fleisch in einer Mischung gleichzusetzen sind. Für Myoglobin und die vier roten misst nicht überall der Fall ist. Die Ebenen sind in der Regel Spezies abhängig, mit Schweinefleisch der untersten Ebene der vier zeigt. Darüber hinaus variiert die Myoglobin-Ebene mit Fleisch schneiden und Alter der Tiere. So obwohl Verhältnisse des Übergangs Peakflächen Karte zuverlässig Verhältnisse von Myoglobin, ist die Zuordnung zu Verhältnis der tatsächlichen Fleisch eine Schätzung Zeichnung auf Annahmen in Bezug auf wahrscheinlichen Quellen des Fleisches in der Mischung.
Der Ansatz in dieser Arbeit skizziert unterscheidet sich in mehrfacher Hinsicht von anderen veröffentlichten Beiträge. Eine typischere Route ist proteomic Methoden verwenden verschiedene unterschiedliche Arten abhängigen Markerpeptide zu identifizieren, wobei die Markierungen für die verschiedenen Arten keine besondere Beziehung besitzen miteinander 8-12,14,19. Im Gegensatz dazu haben wir Proteine , die für alle Arten von Interesse ausgewählt von bis zu artspezifischen Sequenz 3 Varianten. Abgesehen davon, dass im Mittelpunkt unserer relativen Quantifizierung Strategie, hat dies den Vorteil, dass die ProbeVorbereitungsstrategien optimiert werden. Darüber hinaus könnte eine solche entsprechenden Proteine in ähnlicher Weise beispielsweise zu verhalten erwartet werden, in Extraktions- oder in der kommerziellen Verarbeitung von Proben, wie beispielsweise Kochen oder canning. Artbestimmung geht dann normalerweise über den Nachweis von unterschiedlichen Markerpeptide, während in den CPCP Ansatz zur Bestimmung von Arten Erlöse über den Nachweis von eng verwandten Peptide typischerweise ein oder zwei Sequenzunterschiede aufweisen. Schließlich Quantifizierung von Proteinen , die Gewichtsprozent von einer Spezies in eine andere zu schätzen konventionell über absolute Quantifizierung jedes Protein separat auf bekannte Standards gehen könnte 7,14,15. Jedoch mit der CPCP Verfahren keine Notwendigkeit für Kalibrierverfahren besteht. Stattdessen werden relativen Pegel durch den Vergleich Signalstärken von zwei entsprechenden Peptide, die aus den beiden Arten geschätzt, insgesamt die absolute Messstufe zu umgehen. Da das Endziel ist ein Gewichtsanteil von einer Spezies in another, eine relative Quantifizierung, ist die CPCP sowohl direkter und einfacher als zwei absolute Quantifizierungsmessungen verglichen wird. Diese Funktionen übersetzen in kurzen experimentellen Zeiten, erwartet etwa zwei Stunden unter Verwendung von raffiniertem Protokolle zu sein, so dass die Technik nützlich als schnelle Überwachungs-Tool im Bereich der Lebensmittelbetrugserkennung.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We acknowledge financial support from Institute of Food research BBSRC Core Strategic Grant funds, BBSRC Project BB/J004545/1.
Materials
| Uniprot database | www.uniprot.org | Freely accessible database of protein sequences | |
| Skyline software | www.skyline.gs.washington.edu | Free software to download that enables the creation of targeted methods for proteomic studies, peptide and fragment prediction | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich Co Ltd, Gillingham, UK www.sigmaaldrich.com | O9830 | |
| Methanol, HPLC grade | Fisher Scientific, Loughoborough, UK www. fisher.co.uk | 10674922 | |
| Acetonitrile, HPLC grade | Fisher Scientific, Loughoborough, UK www. fisher.co.uk | 10010010 | |
| Urea | Sigma-Aldrich Co Ltd, Gillingham, UK www.sigmaaldrich.com | U5378 | |
| Trypsin(from bovine pancreas treated with TPCK) | Sigma-Aldrich Co Ltd, Gillingham, UK www.sigmaaldrich.com | T1426 | |
| Formic acid | Sigma-Aldrich Co Ltd, Gillingham, UK www.sigmaaldrich.com | F0507 | |
| Coomassie Plus Protein Assay Reagent | Thermo Fisher Scientific www.thermofisher.com | 1856210 | |
| Protein standard | Sigma-Aldrich Co Ltd, Gillingham, UK www.sigmaaldrich.com | P0914 | |
| Ultra Turrax homogeniser T25 | Fisher Scientific, Loughoborough, UK www. fisher.co.uk | 13190693 | |
| Edmund and Buhler KS10 lab shaker | |||
| Heraeus Fresco 17 Centrifuge | Thermo Fisher Scientific www.thermoscientific.com | 75002420 | |
| Vacuum centrifuge RC 1022 | Jouan | ||
| Plate Reader | |||
| Strata-X 33u polymeric reversed-phase cartridges 60 mg/3 ml tubes | Phenomenex, Macclesfield, UK | 8B-S100-UBJ | |
| 4000 QTrap triple-quadrupole mass spectrometer | AB Sciex, Warrington, UK www.sciex.com | ||
| 1200 rapid resolution LC system | Agilent, Stockport, UK | ||
| XB C18 reversed-phase capillary column (100 x 2.1mm, 2.6µ particle size) | Phenomenex, Macclesfield, UK www.phenomenex.com | ||
| Analyst 1.6.2 software | AB Sciex, Warrington, UK www.sciex.com | QTrap data acquisition and analysis, including peak area integration | |
| Autosampler vials |
References
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