Specie determinazione e la quantificazione in miscele Utilizzando MRM Spettrometria di massa dei peptidi applicata per l'autenticazione a base di carne
Summary
We present a protocol for identifying and quantifying the components in mixtures of species possessing similar proteins. Mass spectrometry detects peptides for identification, and gives relative quantitation by ratios of peak areas. As a tool food for fraud detection, the method can detect 1% horse in beef.
Abstract
We describe a simple protocol for identifying and quantifying the two components in binary mixtures of species possessing one or more similar proteins. Central to the method is the identification of ‘corresponding proteins’ in the species of interest, in other words proteins that are nominally the same but possess species-specific sequence differences. When subject to proteolysis, corresponding proteins will give rise to some peptides which are likewise similar but with species-specific variants. These are ‘corresponding peptides’. Species-specific peptides can be used as markers for species determination, while pairs of corresponding peptides permit relative quantitation of two species in a mixture. The peptides are detected using multiple reaction monitoring (MRM) mass spectrometry, a highly specific technique that enables peptide-based species determination even in complex systems. In addition, the ratio of MRM peak areas deriving from corresponding peptides supports relative quantitation. Since corresponding proteins and peptides will, in the main, behave similarly in both processing and in experimental extraction and sample preparation, the relative quantitation should remain comparatively robust. In addition, this approach does not need the standards and calibrations required by absolute quantitation methods. The protocol is described in the context of red meats, which have convenient corresponding proteins in the form of their respective myoglobins. This application is relevant to food fraud detection: the method can detect 1% weight for weight of horse meat in beef. The corresponding protein, corresponding peptide (CPCP) relative quantitation using MRM peak area ratios gives good estimates of the weight for weight composition of a horse plus beef mixture.
Introduction
The European horse meat scandal of 2013, in which undeclared horse meat was found in a number of supermarket beef products1, highlights the need for testing methods capable of detecting and measuring food fraud in meat. Several technologies have been explored, especially enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and DNA-based methods2. An alternative route, based on mass spectrometry, targets species-specific peptides which in turn arise from species-specific proteins. Here we outline one such peptide-based approach that offers both identification and relative quantitation of the adulterant species in a meat mixture3.
The protocol is framed in the context of red meats and the desire to determine the presence of one in another at the level of 1% by weight, the level considered by some to represent fraudulent food adulteration as opposed to contamination4. The method relies in the first instance on identifying a protein which is nominally ‘the same’ in all target meats. Myoglobin, the protein responsible for the red color of meat, is a good candidate since it is abundant, relatively heat tolerant and water soluble, and has been used for species determination of meat previously5,6. The myoglobins for beef (Bos Taurus), pork (Sus scrofa), horse (Equus caballus) and lamb (Ovis aries)3, for instance, are nominally the same, as required, but their sequences are not identical. Such groups of ‘similar but different’ proteins, like these four myoglobins, can conveniently be described as ‘corresponding proteins’. The sequence differences in these four myoglobins are species-specific: for example, the full myoglobin proteins for beef and horse, P02192 and P68082 respectively, each comprise 154 amino acids with 18 sequence differences between the two. Subject to proteolysis using trypsin these proteins produce two sets of peptides, some of which are identical, and some which show one or more species-specific amino acid differences: corresponding proteins therefore give rise to corresponding peptides.
The CPCP approach, therefore, seeks first to identify proteins from two or more species where these proteins exhibit limited species-specific sequence variants. These are corresponding proteins. Following proteolysis, corresponding proteins give rise to peptides, some of which likewise display species-specific sequence variants inherited from the parent protein. These are corresponding peptides. The CPCP approach can be used to compare levels of two corresponding proteins in a mixed species sample by monitoring the levels of corresponding peptides.
The natural technology for the detection of known peptides is multiple reaction monitoring mass spectrometry, or MRM-MS7. Species-specific peptides yield precursor ions, which along with their mass spectrometry fragment ions, are easily itemized in advance by software tools. These lists are then used to instruct the mass spectrometer to record only specific precursor plus fragment ion pairs, called transitions. A particular target peptide is therefore identified not only by its retention time in the chromatography preceding the mass spectrometer, but also by a set of transitions sharing a common precursor ion. This is a highly selective means of detecting known peptides that makes efficient use of the mass spectrometer resource.
Other authors have used mass spectrometry to test for meat adulteration via peptide markers but from disparate proteins8-14. Using the corresponding proteins, corresponding peptides (CPCP) scheme, however, means experimental conditions can be optimized, aiding identification of the species in the mixture from known species-specific transitions. In addition, corresponding proteins and peptides will generally behave similarly in the extraction, proteolysis and detection stages. Since transition peak areas are quantitative and reproducible, ratios of peak areas arising from pairs of corresponding peptides from different species provide a direct estimate of the relative quantities of two meats in a mixture. In contrast, more traditional quantitation routes exploit calibrations based on reference materials to establish absolute quantitation14,15.
Though the protocol is outlined in the context of myoglobin and meat, proteins other than myoglobin could be used for identification and relative quantitation via the CPCP strategy in meat mixtures, though potentially with modifications to the protocol. In addition the strategy is also applicable to binary mixtures of other species sharing one or more corresponding proteins.
The starting point for the protocol is purified ‘reference’ myoglobin, which for some species can be purchased but which for others must be prepared by conventional size-exclusion chromatography. The procedure for preparing reference myoglobin is not included in the protocol, but is described elsewhere3. Software tools16 are used to list candidate peptides and transitions arising from myoglobins of interest. Each reference myoglobin is subjected to proteolysis and the resultant peptides analyzed by liquid chromatography electrospray ionization tandem mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS) to discover which of the candidate precursor ions and transitions are most useful, and to determine the matching peptide retention times. The outcome of this stage is a revised list of target peptides with their transitions, suitable for species determination, and a list of CPCP pairs, suitable for relative quantitation. To test real meats, sample extractions are prepared then subjected to proteolysis to generate peptides both from myoglobin and other extraneous proteins. The myoglobin-based peptides are then monitored by LC-ESI-MS/MS based on their listed transitions. The species present in a mixture are identified by the transition peaks associated with marker peptides. Estimates of the relative amounts of two meats in a binary mixture are calculated using ratios of transition peak areas. A set of test mixtures of pairs of meats will allow the ratio of peak areas for a given pair of transitions to be checked and calibrated against actual mixtures.
Protocol
Representative Results
Discussion
La scelta di un adatto proteina bersaglio è importante. Una buona proteina bersaglio ha bisogno di avere corrispondenti forme in specie di interesse, sufficiente variazione di sequenza specie-dipendente, specificità di specie, ed esistono in quantità accessibili all'interno degli organismi. Per valutare le miscele che hanno subito la lavorazione (per esempio, trattamento termico), una proteina avente una sequenza relativamente immune a che l'elaborazione è desiderabile. La mioglobina è un buon candidato per carni rosse, tra cui carni rosse cotte, ma non è l'unica possibilità. Una volta che la proteina bersaglio è deciso, la parte più critica del protocollo è la proteolisi di proteine. Una proteina diversa dalla mioglobina può ben chiedere un protocollo proteolisi alternativa.
Il protocollo, come descritto include un segmento sulla base di riferimento purificata proteine. Questo mira a scoprire finestre temporali di conservazione e adatti ioni precursori e frammenti. Questo segmento è molto utile, ma non indispensabile.
<pclass = "jove_content"> Anche se corrispondenti coppie di peptidi di due specie di interesse possono essere incluso anche senza esperienza, a volte è il caso che una differenza sequenza ha conseguenze drammatiche sul profilo digestione. Ad esempio, la coppia peptide VLGFHG (manzo) e ELGFQG (cavallo) danno un risultato quantificazione anomala (manifesta come gradiente inferiore a quella della Figura 2). Questo perché quest'ultimo peptide deriva da una fenditura KE relativamente soppressa, provocando un sotto-stima del livello di cavallo nella miscela. Corrispondenti peptidi che iniziano con differenti aminoacidi sono quindi meglio evitare. Spesso i frammenti di due peptidi corrispondenti sono sequenze di amminoacidi identici e sono ben educati, ma questo non è sempre il caso e deve essere controllato durante lo sviluppo del metodo. l'identificazione delle specie è molto meno sensibile a questi problemi rispetto relativa quantificazione.Il protocollo è stato dimostrato per quattro carni rosses 3. Specie carne aggiuntivi possono essere inclusi, anche se la qualità della forma del picco transizione può deteriorarsi se troppe peptidi marcatori co-eluire, riducendo il tempo di permanenza e alla fine degradare stime quantificazione relativa. strumentazione migliorata, già disponibili, migliorerà questo. Un problema correlato è che non tutte le carni hanno diverse mioglobine. Ad esempio, cavallo, asino e mioglobine zebra sono identici e quindi a rigor di termini il metodo è solo in grado di rilevare a cavallo o asino o di zebra nel settore delle carni. In alcuni casi, anche se mioglobine non sono identici, alcuni peptidi chiave possono essere. Per esempio, alcuni agnello mioglobina derivato peptidi marcatori appaiono anche in capra.
Una complicazione di fronte a questo e qualsiasi altro metodo di quantificazione a base di proteine è che il livello di proteina deve essere assunta costante in tutte le specie se i livelli di proteine o peptidi sono di equiparare banalmente a livelli di carni in una miscela. Per mioglobina e quattro rossi mmangia questo non è universalmente vero. I livelli in generale sono specie dipendenti, con carne di maiale che espongono il livello più basso dei quattro. Inoltre, il livello mioglobina varia con carne tagliata ed età degli animali. Quindi, anche se i rapporti delle aree dei picchi di transizione mappa in modo affidabile a rapporti di mioglobina, la mappatura al rapporto di carni effettivamente è un disegno stima su ipotesi relative probabili fonti di carni nella miscela.
L'approccio descritto in questo lavoro differisce in vari modi da altri contributi pubblicati. Un percorso più tipico è quello di utilizzare metodi di proteomica per identificare i vari disparate peptidi marcatore Specie-dipendente, nel qual caso i marcatori per le diverse specie possiedono alcuna relazione particolare uno con l'altro 8-12,14,19. Al contrario, abbiamo selezionato proteine comuni a tutte le specie di interesse fino a specie dipendenti dalla sequenza varianti 3. Oltre ad essere al centro della nostra strategia quantificazione relativa, ciò ha il vantaggio che il campionestrategie di preparazione possono essere ottimizzati. Inoltre, tali proteine corrispondenti possono essere tenuti a comportarsi in modo simile, ad esempio, per l'estrazione e nella lavorazione commerciale di campioni come cucinare o conserve. l'identificazione delle specie allora normalmente procede tramite il rilevamento di peptidi marcatori disparati, mentre nell'approccio CPCP ricavato identificazione delle specie tramite il rilevamento di peptidi strettamente correlati che possiedono in genere uno o due differenze di sequenza. Infine, la quantificazione delle proteine per stimare la percentuale in peso di una specie in un'altra potrebbe convenzionalmente procedere tramite quantificazione assoluta di ciascuna proteina basata separatamente su standard noti 7,14,15. Tuttavia con il metodo CPCP vi è alcuna necessità di metodi di calibrazione. Invece, i livelli relativi sono stimati confrontando punti di forza delle due peptidi corrispondenti delle due specie di segnale, bypassando la fase di misura assoluta del tutto. Dal momento che l'obiettivo finale è una percentuale in peso di una specie in another, una quantificazione relativa, allora il CPCP è sia più diretto e più semplice di confronto tra due misurazioni assolute di quantificazione. Queste caratteristiche si traducono in tempi brevi sperimentali, previsti in circa due ore utilizzando i protocolli raffinati, rendendo la tecnica utile come strumento di sorveglianza rapida nel regno di rilevamento delle frodi alimentari.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We acknowledge financial support from Institute of Food research BBSRC Core Strategic Grant funds, BBSRC Project BB/J004545/1.
Materials
| Uniprot database | www.uniprot.org | Freely accessible database of protein sequences | |
| Skyline software | www.skyline.gs.washington.edu | Free software to download that enables the creation of targeted methods for proteomic studies, peptide and fragment prediction | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich Co Ltd, Gillingham, UK www.sigmaaldrich.com | O9830 | |
| Methanol, HPLC grade | Fisher Scientific, Loughoborough, UK www. fisher.co.uk | 10674922 | |
| Acetonitrile, HPLC grade | Fisher Scientific, Loughoborough, UK www. fisher.co.uk | 10010010 | |
| Urea | Sigma-Aldrich Co Ltd, Gillingham, UK www.sigmaaldrich.com | U5378 | |
| Trypsin(from bovine pancreas treated with TPCK) | Sigma-Aldrich Co Ltd, Gillingham, UK www.sigmaaldrich.com | T1426 | |
| Formic acid | Sigma-Aldrich Co Ltd, Gillingham, UK www.sigmaaldrich.com | F0507 | |
| Coomassie Plus Protein Assay Reagent | Thermo Fisher Scientific www.thermofisher.com | 1856210 | |
| Protein standard | Sigma-Aldrich Co Ltd, Gillingham, UK www.sigmaaldrich.com | P0914 | |
| Ultra Turrax homogeniser T25 | Fisher Scientific, Loughoborough, UK www. fisher.co.uk | 13190693 | |
| Edmund and Buhler KS10 lab shaker | |||
| Heraeus Fresco 17 Centrifuge | Thermo Fisher Scientific www.thermoscientific.com | 75002420 | |
| Vacuum centrifuge RC 1022 | Jouan | ||
| Plate Reader | |||
| Strata-X 33u polymeric reversed-phase cartridges 60 mg/3 ml tubes | Phenomenex, Macclesfield, UK | 8B-S100-UBJ | |
| 4000 QTrap triple-quadrupole mass spectrometer | AB Sciex, Warrington, UK www.sciex.com | ||
| 1200 rapid resolution LC system | Agilent, Stockport, UK | ||
| XB C18 reversed-phase capillary column (100 x 2.1mm, 2.6µ particle size) | Phenomenex, Macclesfield, UK www.phenomenex.com | ||
| Analyst 1.6.2 software | AB Sciex, Warrington, UK www.sciex.com | QTrap data acquisition and analysis, including peak area integration | |
| Autosampler vials |
References
- O’Mahony, P. J. Finding horse meat in beef products-a global problem. QJM-An Int. J. Med. 106, 595-597 (2013).
- Sentandreu, M. A., Sentandreu, E. Authenticity of meat products: Tools against fraud. Food Res. Int. 60, 19-29 (2014).
- Watson, A. D., Gunning, Y., Rigby, N. M., Philo, M., Kemsley, E. K. Meat Authentication via Multiple Reaction Monitoring Mass Spectrometry of Myoglobin Peptides. Anal. Chem. 87, 10315-10322 (2015).
- Food Standards Agency. . Report of the investigation by the Food Standards Agency into incidents of adulteration of comminuted beef products with horse meat and DNA. , (2013).
- Taylor, A. J., Linforth, R., Weir, O., Hutton, T., Green, B. Potential of electrospray mass-spectrometry for meat pigment identification. Meat Science. 33, 75-83 (1993).
- Ponce-Alquicira, E., Taylor, A. J. Extraction and ESI-CID-MS/MS analysis of myoglobins from different meat species. Food Chem. 69, 81-86 (2000).
- Gallien, S., Duriez, E., Domon, B. Selected reaction monitoring applied to proteomics. J. Mass Spectrom. 46, 298-312 (2011).
- Orduna, A. R., Husby, E., Yang, C. T., Ghosh, D., Beaudry, F. Assessment of meat authenticity using bioinformatics, targeted peptide biomarkers and high-resolution mass spectrometry. Food Addit. Contam. Part A-Chem. 32, 1709-1717 (2015).
- Claydon, A. J., Grundy, H. H., Charlton, A. J., Romero, M. R. Identification of novel peptides for horse meat speciation in highly processed foodstuffs. Food Addit. Contam. Part A-Chem. 32, 1718-1729 (2015).
- von Bargen, C., Brockmeyer, J., Humpf, H. U. Meat Authentication: A New HPLC-MS/MS Based Method for the Fast and Sensitive Detection of Horse and Pork in Highly Processed Food. J. Agric. Food Chem. 62, 9428-9435 (2014).
- von Bargen, C., Dojahn, J., Waidelich, D., Humpf, H. U., Brockmeyer, J. New Sensitive High-Performance Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry Method for the Detection of Horse and Pork in Halal Beef. J. Agric. Food Chem. 61, 11986-11994 (2013).
- Montowska, M., Alexander, M. R., Tucker, G. A., Barrett, D. A. Authentication of processed meat products by peptidomic analysis using rapid ambient mass spectrometry. Food Chem. 187, 297-304 (2015).
- Montowska, M., Alexander, M. R., Tucker, G. A., Barrett, D. A. Rapid detection of Peptide markers for authentication purposes in raw and cooked meat using ambient liquid extraction surface analysis mass spectrometry. Anal. Chem. 86, 10257-10265 (2014).
- Sentandreu, M. A., Fraser, P. D., Halket, J., Patel, R., Bramley, P. M. A Proteomic-Based Approach for Detection of Chicken in Meat Mixes. J. Proteome Res. 9, 3374-3383 (2010).
- Elliott, M. H., Smith, D. S., Parker, C. E., Borchers, C. Current trends in quantitative proteomics. J. Mass Spectrom. 44, 1637-1660 (2009).
- MacLean, B., et al. Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments. Bioinformatics. 26, 966-968 (2010).
- Keeton, J. T., Ellerbeck, S. M., Nunez de Gonzalez, M. T., Devine, C., Dikeman, M. . Encyclopedia of Meat Sciences. 1, 235-243 (2014).
- Montowska, M., Alexander, M. R., Tucker, G. A., Barrett, D. A. Rapid Detection of Peptide Markers for Authentication Purposes in Raw and Cooked Meat Using Ambient Liquid Extraction Surface Analysis Mass Spectrometry. Anal. Chem. 86, 10257-10265 (2014).
