تحديد الأنواع والكميات في مخاليط عن طريق MRM الطيف الكتلي من الببتيدات التطبيقية للمصادقة اللحوم
Summary
We present a protocol for identifying and quantifying the components in mixtures of species possessing similar proteins. Mass spectrometry detects peptides for identification, and gives relative quantitation by ratios of peak areas. As a tool food for fraud detection, the method can detect 1% horse in beef.
Abstract
We describe a simple protocol for identifying and quantifying the two components in binary mixtures of species possessing one or more similar proteins. Central to the method is the identification of ‘corresponding proteins’ in the species of interest, in other words proteins that are nominally the same but possess species-specific sequence differences. When subject to proteolysis, corresponding proteins will give rise to some peptides which are likewise similar but with species-specific variants. These are ‘corresponding peptides’. Species-specific peptides can be used as markers for species determination, while pairs of corresponding peptides permit relative quantitation of two species in a mixture. The peptides are detected using multiple reaction monitoring (MRM) mass spectrometry, a highly specific technique that enables peptide-based species determination even in complex systems. In addition, the ratio of MRM peak areas deriving from corresponding peptides supports relative quantitation. Since corresponding proteins and peptides will, in the main, behave similarly in both processing and in experimental extraction and sample preparation, the relative quantitation should remain comparatively robust. In addition, this approach does not need the standards and calibrations required by absolute quantitation methods. The protocol is described in the context of red meats, which have convenient corresponding proteins in the form of their respective myoglobins. This application is relevant to food fraud detection: the method can detect 1% weight for weight of horse meat in beef. The corresponding protein, corresponding peptide (CPCP) relative quantitation using MRM peak area ratios gives good estimates of the weight for weight composition of a horse plus beef mixture.
Introduction
The European horse meat scandal of 2013, in which undeclared horse meat was found in a number of supermarket beef products1, highlights the need for testing methods capable of detecting and measuring food fraud in meat. Several technologies have been explored, especially enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and DNA-based methods2. An alternative route, based on mass spectrometry, targets species-specific peptides which in turn arise from species-specific proteins. Here we outline one such peptide-based approach that offers both identification and relative quantitation of the adulterant species in a meat mixture3.
The protocol is framed in the context of red meats and the desire to determine the presence of one in another at the level of 1% by weight, the level considered by some to represent fraudulent food adulteration as opposed to contamination4. The method relies in the first instance on identifying a protein which is nominally ‘the same’ in all target meats. Myoglobin, the protein responsible for the red color of meat, is a good candidate since it is abundant, relatively heat tolerant and water soluble, and has been used for species determination of meat previously5,6. The myoglobins for beef (Bos Taurus), pork (Sus scrofa), horse (Equus caballus) and lamb (Ovis aries)3, for instance, are nominally the same, as required, but their sequences are not identical. Such groups of ‘similar but different’ proteins, like these four myoglobins, can conveniently be described as ‘corresponding proteins’. The sequence differences in these four myoglobins are species-specific: for example, the full myoglobin proteins for beef and horse, P02192 and P68082 respectively, each comprise 154 amino acids with 18 sequence differences between the two. Subject to proteolysis using trypsin these proteins produce two sets of peptides, some of which are identical, and some which show one or more species-specific amino acid differences: corresponding proteins therefore give rise to corresponding peptides.
The CPCP approach, therefore, seeks first to identify proteins from two or more species where these proteins exhibit limited species-specific sequence variants. These are corresponding proteins. Following proteolysis, corresponding proteins give rise to peptides, some of which likewise display species-specific sequence variants inherited from the parent protein. These are corresponding peptides. The CPCP approach can be used to compare levels of two corresponding proteins in a mixed species sample by monitoring the levels of corresponding peptides.
The natural technology for the detection of known peptides is multiple reaction monitoring mass spectrometry, or MRM-MS7. Species-specific peptides yield precursor ions, which along with their mass spectrometry fragment ions, are easily itemized in advance by software tools. These lists are then used to instruct the mass spectrometer to record only specific precursor plus fragment ion pairs, called transitions. A particular target peptide is therefore identified not only by its retention time in the chromatography preceding the mass spectrometer, but also by a set of transitions sharing a common precursor ion. This is a highly selective means of detecting known peptides that makes efficient use of the mass spectrometer resource.
Other authors have used mass spectrometry to test for meat adulteration via peptide markers but from disparate proteins8-14. Using the corresponding proteins, corresponding peptides (CPCP) scheme, however, means experimental conditions can be optimized, aiding identification of the species in the mixture from known species-specific transitions. In addition, corresponding proteins and peptides will generally behave similarly in the extraction, proteolysis and detection stages. Since transition peak areas are quantitative and reproducible, ratios of peak areas arising from pairs of corresponding peptides from different species provide a direct estimate of the relative quantities of two meats in a mixture. In contrast, more traditional quantitation routes exploit calibrations based on reference materials to establish absolute quantitation14,15.
Though the protocol is outlined in the context of myoglobin and meat, proteins other than myoglobin could be used for identification and relative quantitation via the CPCP strategy in meat mixtures, though potentially with modifications to the protocol. In addition the strategy is also applicable to binary mixtures of other species sharing one or more corresponding proteins.
The starting point for the protocol is purified ‘reference’ myoglobin, which for some species can be purchased but which for others must be prepared by conventional size-exclusion chromatography. The procedure for preparing reference myoglobin is not included in the protocol, but is described elsewhere3. Software tools16 are used to list candidate peptides and transitions arising from myoglobins of interest. Each reference myoglobin is subjected to proteolysis and the resultant peptides analyzed by liquid chromatography electrospray ionization tandem mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS) to discover which of the candidate precursor ions and transitions are most useful, and to determine the matching peptide retention times. The outcome of this stage is a revised list of target peptides with their transitions, suitable for species determination, and a list of CPCP pairs, suitable for relative quantitation. To test real meats, sample extractions are prepared then subjected to proteolysis to generate peptides both from myoglobin and other extraneous proteins. The myoglobin-based peptides are then monitored by LC-ESI-MS/MS based on their listed transitions. The species present in a mixture are identified by the transition peaks associated with marker peptides. Estimates of the relative amounts of two meats in a binary mixture are calculated using ratios of transition peak areas. A set of test mixtures of pairs of meats will allow the ratio of peak areas for a given pair of transitions to be checked and calibrated against actual mixtures.
Protocol
Representative Results
Discussion
اختيار بروتين الهدف مناسبة مهمة. يحتاج البروتين هدفا جيدا لأشكال المقابلة في الأنواع ذات الأهمية، يكفي تعتمد الأنواع تسلسل الاختلاف، خصوصية الأنواع، وتوجد بكميات الوصول إليها داخل الكائنات الحية. لتقييم الخلائط التي خضعت لمعالجة (على سبيل المثال، المعالجة الحرارية)، وهو بروتين وجود تسلسل محصنة نسبيا إلى أن معالجة أمر مرغوب فيه. الميوجلوبين هو مرشح جيد للحوم الحمراء، بما في ذلك اللحوم الحمراء المطبوخة، ولكن ليس هو الاحتمال الوحيد. مرة واحدة يتم تحديد البروتين المستهدف، والجزء الأكثر أهمية من البروتوكول هو التحلل البروتيني بروتين. بروتين مختلفة من الميوجلوبين قد تتطلب كذلك بروتوكول التحلل البروتيني البديل.
البروتوكول كما هو موضح يشمل شريحة على أساس مرجعية تنقية البروتين. هذا ويهدف إلى اكتشاف ويندوز الوقت الاحتفاظ والسلائف وتفتيت أيونات مناسبة. هذا الجزء هو مفيد جدا ولكن ليس من الضروري.
<pالطبقة = "jove_content"> وعلى الرغم من أزواج الببتيد المقابلة من نوعين من الفائدة يمكن سرد حتى من دون التجربة، هو الحال أن الفرق تسلسل له عواقب وخيمة على البيانات الشخصية الهضم في بعض الأحيان. على سبيل المثال، الزوج الببتيد VLGFHG (لحوم البقر) وELGFQG (الحصان) يعطي نتيجة الكميات الشاذة (اضح كما الانحدار أقل من واحد في الشكل 2). وذلك لأن الببتيد الأخير ينشأ من الانقسام KE قمع نسبيا، مما تسبب في والتقدير تحت مستوى الحصان في الخليط. لذا أفضل وتجنب المقابلة الببتيدات بدءا من الأحماض الأمينية المختلفة. في كثير من الأحيان شظايا من اثنين من الببتيدات المقابلة لها تسلسل الأحماض الأمينية متطابقة وتصرفت بشكل جيد، ولكن هذا ليس هو الحال دائما، ويجب أن يتم التحقق من خلال تطوير الأسلوب. تحديد الأنواع هو أقل حساسية بكثير لهذه القضايا من الكميات النسبية.وقد تجلى البروتوكول لمدة أربعة اللحوم الحمراءالصورة 3. يمكن تضمين أنواع اللحوم إضافية، على الرغم من أن نوعية ذروة شكل التحول قد تتدهور إذا كان الكثير من الببتيدات علامة شارك في أزل، والحد من فعالية زمن السكون والمهينة في نهاية المطاف تقديرات الكميات النسبية. وتحسين الأجهزة، والمتاحة بالفعل، وتحسين هذا. ومن المسائل ذات الصلة هي أن ليس كل اللحوم لها myoglobins مختلفة. على سبيل المثال، حصان، حمار وحمار وحشي myoglobins متطابقة وبالتالي بالمعنى الدقيق للكلمة فإن هذه الطريقة الوحيدة القادرة على الكشف عن حصان أو حمار أو حمار وحشي في لحوم البقر. في بعض الحالات، على الرغم من myoglobins ليست متطابقة، أن بعض الببتيدات الرئيسية أن يكون. على سبيل المثال، تظهر بعض الضأن المستمدة من الميوجلوبين الببتيدات علامة أيضا في الماعز.
ومن المضاعفات التي تواجه هذه وغيرها من أي طريقة الكميات المعتمدة على البروتين هي أن مستوى البروتين يجب أن يفترض المستمر في جميع الأنواع إذا كانت مستويات بروتين أو ببتيد هي مساواة مسلي إلى مستويات اللحوم في الخليط. لالميوجلوبين وم أحمر أربعةيأكل هذا ليس صحيحا عالميا. المستويات في عام هي الأنواع التي تعتمد، مع لحم الخنزير واظهار أدنى مستوى في أربعة. وبالإضافة إلى ذلك، يختلف مستوى الميوجلوبين مع قطع اللحم وعمر الحيوان. وذلك على الرغم نسب مناطق ذروة التحول خريطة موثوق بها إلى نسب الميوجلوبين، التعيين إلى نسبة اللحوم الفعلية هو الرسم التقدير على افتراضات بشأن المصادر المحتملة من اللحوم في الخليط.
النهج المبين في هذا العمل يختلف في عدد من الطرق من مساهمات أخرى منشورة. والطريق أكثر نموذجية لاستخدام أساليب البروتين لتحديد مختلف المتباينة الببتيدات علامة تعتمد على الأنواع، وفي هذه الحالة علامات الأنواع المختلفة تمتلك أي علاقة خاصة مع واحد 8-12،14،19 آخر. على النقيض من ذلك، فقد اخترنا البروتينات مشتركة بين جميع الأنواع من الفوائد حتى الأنواع التي تعتمد على تسلسل المتغيرات 3. وبصرف النظر عن كونها أساسية لاستراتيجيتنا الكميات النسبية، وهذا له ميزة أن عينةيمكن أن يكون الأمثل استراتيجيات الإعداد. وبالإضافة إلى ذلك، قد يكون من المتوقع أن تتصرف على نحو مماثل، على سبيل المثال، في استخراج أو في تجهيز التجارية من عينات مثل الطبخ أو تعليب هذه البروتينات المقابلة. تحديد الأنواع ثم تنتقل عادة عن طريق الكشف عن الببتيدات علامة المتباينة، في حين أنه في نهج CPCP عائدات تحديد الأنواع عن طريق الكشف عن الببتيدات ذات صلة وثيقة امتلاك عادة واحد أو اثنين من الاختلافات التسلسل. وأخيرا، الكميات من البروتينات لتقدير في المئة من وزنها من نوع واحد في آخر قد انتقل تقليديا عن طريق تحديد الكميات المطلقة من كل من البروتين على أساس منفصل عن المعايير المعروفة 7،14،15. ومع ذلك باستخدام طريقة CPCP ليست هناك حاجة لأساليب المعايرة. بدلا من ذلك، يتم تقدير المستويات النسبية من خلال مقارنة قوة الإشارة في اثنين من المقابلة الببتيدات من هذين النوعين، وتجاوز مرحلة قياس المطلقة تماما. لأن الهدف النهائي هو نسبة وزنا من نوع واحد شرجيذر، والكميات النسبية، ثم CPCP على حد سواء أكثر مباشرة وبساطة من المقارنة بين اثنين من قياسات الكميات المطلقة. هذه الميزات تترجم مرات تجريبية قصيرة، متوقعا أن يكون ما يقرب من ساعة باستخدام بروتوكولات المكررة، مما يجعل هذه التقنية مفيدة كأداة المراقبة السريعة في مجال الكشف عن الغش الغذائي.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We acknowledge financial support from Institute of Food research BBSRC Core Strategic Grant funds, BBSRC Project BB/J004545/1.
Materials
| Uniprot database | www.uniprot.org | Freely accessible database of protein sequences | |
| Skyline software | www.skyline.gs.washington.edu | Free software to download that enables the creation of targeted methods for proteomic studies, peptide and fragment prediction | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich Co Ltd, Gillingham, UK www.sigmaaldrich.com | O9830 | |
| Methanol, HPLC grade | Fisher Scientific, Loughoborough, UK www. fisher.co.uk | 10674922 | |
| Acetonitrile, HPLC grade | Fisher Scientific, Loughoborough, UK www. fisher.co.uk | 10010010 | |
| Urea | Sigma-Aldrich Co Ltd, Gillingham, UK www.sigmaaldrich.com | U5378 | |
| Trypsin(from bovine pancreas treated with TPCK) | Sigma-Aldrich Co Ltd, Gillingham, UK www.sigmaaldrich.com | T1426 | |
| Formic acid | Sigma-Aldrich Co Ltd, Gillingham, UK www.sigmaaldrich.com | F0507 | |
| Coomassie Plus Protein Assay Reagent | Thermo Fisher Scientific www.thermofisher.com | 1856210 | |
| Protein standard | Sigma-Aldrich Co Ltd, Gillingham, UK www.sigmaaldrich.com | P0914 | |
| Ultra Turrax homogeniser T25 | Fisher Scientific, Loughoborough, UK www. fisher.co.uk | 13190693 | |
| Edmund and Buhler KS10 lab shaker | |||
| Heraeus Fresco 17 Centrifuge | Thermo Fisher Scientific www.thermoscientific.com | 75002420 | |
| Vacuum centrifuge RC 1022 | Jouan | ||
| Plate Reader | |||
| Strata-X 33u polymeric reversed-phase cartridges 60 mg/3 ml tubes | Phenomenex, Macclesfield, UK | 8B-S100-UBJ | |
| 4000 QTrap triple-quadrupole mass spectrometer | AB Sciex, Warrington, UK www.sciex.com | ||
| 1200 rapid resolution LC system | Agilent, Stockport, UK | ||
| XB C18 reversed-phase capillary column (100 x 2.1mm, 2.6µ particle size) | Phenomenex, Macclesfield, UK www.phenomenex.com | ||
| Analyst 1.6.2 software | AB Sciex, Warrington, UK www.sciex.com | QTrap data acquisition and analysis, including peak area integration | |
| Autosampler vials |
References
- O’Mahony, P. J. Finding horse meat in beef products-a global problem. QJM-An Int. J. Med. 106, 595-597 (2013).
- Sentandreu, M. A., Sentandreu, E. Authenticity of meat products: Tools against fraud. Food Res. Int. 60, 19-29 (2014).
- Watson, A. D., Gunning, Y., Rigby, N. M., Philo, M., Kemsley, E. K. Meat Authentication via Multiple Reaction Monitoring Mass Spectrometry of Myoglobin Peptides. Anal. Chem. 87, 10315-10322 (2015).
- Food Standards Agency. . Report of the investigation by the Food Standards Agency into incidents of adulteration of comminuted beef products with horse meat and DNA. , (2013).
- Taylor, A. J., Linforth, R., Weir, O., Hutton, T., Green, B. Potential of electrospray mass-spectrometry for meat pigment identification. Meat Science. 33, 75-83 (1993).
- Ponce-Alquicira, E., Taylor, A. J. Extraction and ESI-CID-MS/MS analysis of myoglobins from different meat species. Food Chem. 69, 81-86 (2000).
- Gallien, S., Duriez, E., Domon, B. Selected reaction monitoring applied to proteomics. J. Mass Spectrom. 46, 298-312 (2011).
- Orduna, A. R., Husby, E., Yang, C. T., Ghosh, D., Beaudry, F. Assessment of meat authenticity using bioinformatics, targeted peptide biomarkers and high-resolution mass spectrometry. Food Addit. Contam. Part A-Chem. 32, 1709-1717 (2015).
- Claydon, A. J., Grundy, H. H., Charlton, A. J., Romero, M. R. Identification of novel peptides for horse meat speciation in highly processed foodstuffs. Food Addit. Contam. Part A-Chem. 32, 1718-1729 (2015).
- von Bargen, C., Brockmeyer, J., Humpf, H. U. Meat Authentication: A New HPLC-MS/MS Based Method for the Fast and Sensitive Detection of Horse and Pork in Highly Processed Food. J. Agric. Food Chem. 62, 9428-9435 (2014).
- von Bargen, C., Dojahn, J., Waidelich, D., Humpf, H. U., Brockmeyer, J. New Sensitive High-Performance Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry Method for the Detection of Horse and Pork in Halal Beef. J. Agric. Food Chem. 61, 11986-11994 (2013).
- Montowska, M., Alexander, M. R., Tucker, G. A., Barrett, D. A. Authentication of processed meat products by peptidomic analysis using rapid ambient mass spectrometry. Food Chem. 187, 297-304 (2015).
- Montowska, M., Alexander, M. R., Tucker, G. A., Barrett, D. A. Rapid detection of Peptide markers for authentication purposes in raw and cooked meat using ambient liquid extraction surface analysis mass spectrometry. Anal. Chem. 86, 10257-10265 (2014).
- Sentandreu, M. A., Fraser, P. D., Halket, J., Patel, R., Bramley, P. M. A Proteomic-Based Approach for Detection of Chicken in Meat Mixes. J. Proteome Res. 9, 3374-3383 (2010).
- Elliott, M. H., Smith, D. S., Parker, C. E., Borchers, C. Current trends in quantitative proteomics. J. Mass Spectrom. 44, 1637-1660 (2009).
- MacLean, B., et al. Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments. Bioinformatics. 26, 966-968 (2010).
- Keeton, J. T., Ellerbeck, S. M., Nunez de Gonzalez, M. T., Devine, C., Dikeman, M. . Encyclopedia of Meat Sciences. 1, 235-243 (2014).
- Montowska, M., Alexander, M. R., Tucker, G. A., Barrett, D. A. Rapid Detection of Peptide Markers for Authentication Purposes in Raw and Cooked Meat Using Ambient Liquid Extraction Surface Analysis Mass Spectrometry. Anal. Chem. 86, 10257-10265 (2014).
