Medindo a atividade enzimática de Lactase no laboratório de ensino
Summary
A atividade enzimática da lactase é essencial para o processamento catabólico de lactose o dissacarídeo. Aqui, a atividade da lactase encontrado em suplementos dietéticos é analisada usando um ensaio colorimétrico. Isto fornece aos alunos uma plataforma experimental para a compreensão da atividade da lactase e enzima cinética.
Abstract
Compreender como funcionam as enzimas e isto aos exemplos da vida real, são fundamental para uma ampla gama de graduação em ciências biológicas e biomédicas. Tão fácil de seguir protocolo foi desenvolvido para estudantes de graduação de farmácia primeiros ano e fornece uma introdução de nível básico de reacções enzimáticas e procedimentos analíticos para análise enzimática. A enzima de escolha é a lactase, como este representa um exemplo de uma enzima disponível comercialmente relevante para a prática de doença humana/farmacêutica. Lactase é extraído de comprimidos de suplemento dietético e avaliados usando um ensaio colorimétrico baseado a hidrólise de um substrato artificial para lactase (Orto-nitrofenol –beta-D-galactopyranoside, ONPG). Lançamento do Orto-nitrofenol após a clivagem hidrolítica de ONPG pela lactase é medido por uma alteração na absorbância a 420 nm e o efeito da temperatura sobre a reação enzimática é avaliada por realizar a reação no gelo, à temperatura ambiente e em 37 ° C. Análise mais avançada pode ser implementada usando este protocolo, avaliar a atividade da enzima em condições diferentes e usando diferentes reagentes.
Introduction
As enzimas são um tipo especializado de proteína que agem como catalisadores biológicos, por reações químicas na vida organismos1. A ação de enzimas é fundamental para a vida, fornecendo energia, eliminação de resíduos e permitindo que os organismos funcionar. Enzimas de compreensão é, portanto, fundamental para uma compreensão completa da vida. Esse conhecimento é essencial para uma grande variedade de programas de grau de nível de Universidade, variando de ciências médicas de biologia. Enquanto um fundo detalhado desde princípios de catálise até modelos teóricos da atividade da enzima pode ser fornecido aos estudantes utilizando palestras e material de leitura, as propriedades de reacções enzimáticas são melhor compreendidas pelas mãos na experiência prática de enzimas em ação como previamente demonstraram2. Este protocolo fornece um simples para seguir o paradigma experimental para medir a atividade da enzima em condições de laboratório, utilizando lactase como um exemplo de uma enzima com uma actividade relevante para a saúde e nutrição humana.
A lactase hidrolase glicosídica (CE-3.2.1.23/26) é uma enzima de central importância nutricional para mamíferos3. A atividade da lactase é altamente conservada através da evolução e deriva da família de enzimas beta-galactosidase — uma família presente de Escherichia coli através de Homo sapiens (Figura 1, PDB 1JZ8)4. A importância fundamental da lactase num cenário nutricional humano decorre de seu papel em permitir que a quebra da lactose em seus componentes monossacarídeos constituintes, que podem ser usados para gerar energia no corpo. Lactase catalisa a hidrólise da ligação glicosídica em lactose dissacarídeo, liberando a galactose e a glicose (Figura 2)5. Esses monossacarídeos são usados principalmente para a geração de adenosina trifosfato (ATP) através do ciclo do ácido cítrico e fosforilação oxidativa6. Durante o desenvolvimento infantil e neonato, lactase é altamente expresso no sistema digestivo humano, quebrando à lactose recebida do leite materno de que lactose é o componente primário de hidrato de carbono e uma das principais fontes de nutrição durante os primeiros anos 7. a importância médica de lactase é destacada por deficiência de lactase congênita (CID), uma rara condição autossômica recessiva, causada por mutações no gene da lactase (LCT) que codifica para a enzima de lactase8. Recém-nascidos com CID apresentam pouca atividade de lactase, assim eles não podem ser alimentados com leite materno, qualquer outro tipo de leite ou fórmula que contenha lactose.
Durante a infância, expressão de lactase normalmente é reduzida; no entanto, esta redução após o desmame varia geograficamente, com aproximadamente 35% dos adultos em todo o mundo continua a expressar a enzima9. Expressão sustentado de lactase, conhecido como persistência da lactase, permite que indivíduos continuar a digerir leite e produtos lácteos de uma variedade de fontes. Por outro lado, a perda de expressão de lactase pode levar à intolerância à lactose, também conhecido como adulto-tipo hypolactasia (ATH), resultante de uma incapacidade de quebrar a lactose no intestino. ATH é caracterizada por uma compilação acima de lactose no cólon após a ingestão de lactose, contendo produtos alimentares. No cólon, a lactose acumulada é fermentada pela fauna microbiana do intestino, liberando gases incluindo hidrogênio, metano e dióxido de carbono. A produção desses gases em indivíduos com deficiências de enzima lactase promover distensão abdominal, flatulência aumentada, dor, náusea e borborygmi (rumbling estômago)7. Aumento dos níveis de lactose no tracto digestivo também pode levar a fezes soltas.
O controle da expressão do gene LCT é modulado por polimorfismos localizados em intrões do gene MCM6 nas proximidades. Indivíduos com expressão sustentado de lactase carregam polimorfismos que funcionam como potenciadores distais fortes para a expressão do gene LCT , compensando assim o normal no Regulamento da transcrição de LCT durante o desmame e, consequentemente, sustentar a expressão de lactase na idade adulta3. Polimorfismos de potenciador sugeridos que foram selecionadas positivamente após a domesticação do gado e camelos no Oriente Médio há mais de cinco mil anos de9,10.
Os sintomas resultantes de ATH podem ser gerenciados por reduzir a ingestão de lactose, por exemplo, removendo produtos lácteos da dieta. Uma abordagem alternativa para ATH e a abordagem de escolha para CID, é o uso de suplementos de lactase, amplamente disponíveis em farmácias. Estes suplementos fornecem lactase isolado de uma variedade de fontes, incluindo leveduras e bactérias, em um formulário líquido ou comprimido-based que pode ser tomado com ou adicionado à lactose contendo alimentos. O suplemento vai hidrolisar uma proporção de lactose presente nos alimentos de produtos de glicose e galactose, assim permitindo a sua absorção e evitar o acúmulo de substrato de lactose não digerida no intestino.
Baseado no uso de suplementos de lactase, como uma dieta ajuda, nós desenvolvemos uma experiência de laboratório de enzimologia simples apropriada para primeiro ano biomédica ciência ou farmácia estudantes. Este experimento de laboratório aproveita-se de suplementos de lactase comercialmente disponível e usa orto-nitrofenol –beta-D-galactopyranoside (ONPG) para fornecer um ponto de extremidade colorimétrico para medir a clivagem das ligações glicosídicas por lactase ( Figura 3)11. ONPG atua um substrato artificial para a lactase, que quando submetidos à hidrólise por esta enzima produz a D-galactose e orto-nitrofenol. O último produto tem uma cor amarela, absorve luz no comprimento de onda de 420 nm. Através da quantificação quaisquer alterações em absorvância a 420 seguinte nm a exposição de ONPG a lactase, é possível estimar a atividade desta enzima. Este experimento de laboratório fornece uma demonstração de atividade enzimática hidrolase. Construindo em repetições adicionais e realização de ensaios em diferentes condições, é possível incorporar mais sofisticadas análises de cinética enzimática, proporcionando um valioso exemplo de vida real de enzimas em ação relevante para a saúde humana.
Protocol
Representative Results
Discussion
Um detalhado conhecimento e compreensão das enzimas, reações enzimáticas e cinética enzimática é necessária para uma vasta gama de tópicos abrangendo biologia, biomedicina e farmacologia. O protocolo descrito acima usa lactase como um exemplo de uma enzima relevante para a saúde humana, para demonstrar reações enzimáticas, fornecendo as competências-chave que podem ser usadas em experimentos de laboratório-baseado mais avançados.
Este protocolo foi deliberadamente concebido para ser tão robusto como possíveis, permitindo que os estudantes com pouca ou nenhuma experiência de laboratório molhado para produzir resultados interpretáveis em um curto espaço de tempo. No ano letivo de 2014/2015 da faculdade de farmácia da Universidade de Reading, um total de 144 estudantes, organizados em grupos de 3, realizado o experimento “medindo lactase”, com todos os grupos capazes de detectar algum nível de atividade enzimática de tablet de lactase extratos.
Há uma série de passos críticos no presente protocolo. Em primeiro lugar, é essencial que a extração inicial seja eficiente, permitindo que a solubilização de suficiente enzima activa para análises subsequentes. Em nossa experiência, primeiro ano estudantes podem alcançar isto seguindo o protocolo descritos; no entanto algumas orientações de manifestantes de laboratório era necessária neste momento. Embora parece um ponto óbvio, um fator chave no sucesso deste protocolo é a capacidade de cuidadosamente medir volumes, corretamente rotular tubos e siga as instruções. Enquanto um certo nível de proficiência pode ser assumido por muitos alunos, monitoramento cuidadoso e um pedido claro para que os alunos pedir ajuda no caso em que eles não tem certo de o que fazer em seguida fornece a maior probabilidade de um ensaio bem sucedida.
Avaliação de estudante pode ser efectuada em-classe planilha (disponível como material suplementar), pedindo os alunos observar dados de experimentos, comentário sobre seus resultados e link para informações de plano de fundo/leitura do material da palestra, ou por mais detalhada, sem avaliação de classe com o modelo de dados fornecido permitindo análises cinéticas ser tentada e avaliada.
O protocolo apresentado aqui é um exemplo simples de um ensaio de atividade de lactase sob condições de laboratório de ensino, e há muitas oportunidades para aumentar a complexidade do experimento para permitir análises mais avançadas. Em particular, o protocolo apresentado fornece uma introdução ao conceito de cinética enzimática, mas não permite a análise cinética de dados experimentais. Como tal, recomendamos Visualizar o protocolo descrito como um modelo inicial para classes, com os detalhes precisos, adaptados para atender os objetivos específicos e talentos da coorte estudante realizar os experimentos. Exemplos de experimentos prolongados poderiam incluir: repetidas medições em diferentes temperaturas, usando concentrações de substrato diferentes para permitir a análise estatística, análise cinética de dados (apropriados para estudantes de bioquímica/majors), começando com vários comprimidos diferentes e permitindo que os alunos a avaliar diferente atividade da enzima em cada um (com a adição de tabuletas controle, apropriadas para estudantes de ciência forense/majors), avaliação do impacto de desnaturação térmica ou realização de competição experiências por adição de lactose ou inibidores de lactase (tabela 1). Um protocolo detalhado para análise cinética de lactase já havia sido publicado12.
Uma força importante deste protocolo é que ele combina uma introdução básica à cinética de enzimologia e enzima com um estudo de caso da vida real da enzimologia na medicina. Isso faz com que este laboratório experiência de particular relevância para os estudantes de medicina, farmácia, ciências biomédicas e assuntos relacionados. Importante, o fato de que haja uma condição médica séria e uma questão dietética mais generalizada associada com catabolismo à lactose fornece a oportunidade de criar uma vasta gama de questões éticas e médicas com os alunos. Isto poderia incluir as questões que envolvem testes genéticos para condições médicas e associado a discussões relacionadas a terapia genética e aconselhamento genético, bem como a utilização e venda de suplementos medicinais. Uma limitação importante é que o protocolo não permite a estimativa precisa da concentração de enzima, devido às matérias-primas usadas para a extração. Uma modificação para dar conta disto, no entanto, seria usar a enzima de grau reagente para o ensaio. Importante, isto também permitiria um cálculo mais preciso da cinética para a enzima lactase.
Em conclusão, análise da atividade da lactase em um laboratório de ensino ambiente fornece uma introdução robusta, atraente e interessante para o campo da biologia de enzima para fase inicial estudantes universitários.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
PAL foi financiado por um Parkinson UK Research Fellowship (grant F1002). Este trabalho foi apoiado por um novo investigador MRC Research Grant (Sr/L010933/1) e pelo programa de MRC concede senhor/N026004/1 para PAL e pela bolsa de estudo BBSRC BB/M017222/1 a jato. Agradecemos a coorte de 2014-15 de aposentado parte 1 alunos da Universidade de Reading para tomar parte na primeira iteração deste coortes prático e subsequentes para seus comentários e sugestões.
Materials
| Lactase tablet | Lamberts | 8511-60 | |
| Phosphate buffered saline (powdered) | Sigma | P3813 | Dissolved in deionized water to a final concentration of 100 mM |
| ONPG | Sigma | N1127 | Dissolved in deionized water to a final concentration of 5 mM |
| Sodium Carbonate | Sigma | 451614 | Dissolved in deionized water to a final concentration of 1 M |
| De-ionized water | NA | NA | |
| Pestle and mortar | VWR | ||
| Spectrophotometer | Jenway 6315 | ||
| Pipettes | Gilson | ||
| 15 mL tubes | VWR | ||
| 1.5 mL tubes | Eppendorf | ||
| Spectrophotometer cuvettes | Jenway | ||
| Vortex | Vortex genie 2 | ||
| Centrifuge | Beckman | ||
| Ice bucket | VWR | ||
| Water bath | Thermo-Scientific | ||
| Weighing scales | Thermo-Scientific |
References
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