Mesure de l’activité enzymatique Lactase dans le laboratoire d’enseignement
Summary
L’activité enzymatique de la lactase est essentielle pour le traitement catabolique du lactose disaccharides. Ici, l’activité de la lactase dans les compléments alimentaires est analysée à l’aide d’un dosage colorimétrique. Cela prépare les stagiaires à une plateforme expérimentale permettant de comprendre l’activité de la lactase et enzyme cinétique.
Abstract
Comprendre comment les enzymes fonctionnent et cela concernant les exemples réels, sont essentielles à un large éventail de diplômes de premier cycle en sciences biologiques et biomédicales. Aussi facile à suivre protocole a été développé pour les étudiants de premier cycle de pharmacie première année et fournit une introduction d’entrée de gamme aux réactions enzymatiques et méthodes analytiques pour l’analyse des enzymes. L’enzyme de choix est la lactase, comme il s’agit d’un exemple d’une enzyme commercialement disponible pertinente pour la pratique de la maladie humaine et pharmaceutiques. La lactase est extraite de comprimés de complément alimentaire et évalués à l’aide d’un dosage colorimétrique basée par hydrolyse d’un substrat artificiel de lactase (ortho-nitrophénol –bêta-D-galactopyranoside, ONPG). Libération d’ortho-nitrophénol suite au clivage hydrolytique de l’ONPG en lactase est mesurée par un changement d’absorbance à 420 nm et l’effet de la température sur la réaction enzymatique est évaluée en effectuant la réaction sur la glace, à la température ambiante et à 37 ° C. Une analyse plus approfondie peut être implémentée en utilisant ce protocole en évaluant l’activité enzymatique dans des conditions différentes et en utilisant des réactifs différents.
Introduction
Les enzymes sont un type spécialisé de protéines qui agissent comme des catalyseurs biologiques pour des réactions chimiques dans la vie des organismes1. L’action des enzymes est essentielle pour la vie, fournir de l’énergie, des déchets et permettant aux organismes de fonctionner. Enzymes de la compréhension est donc essentielle pour une compréhension complète de la vie. Une telle connaissance est essentielle pour une grande variété de programmes de diplôme de niveau universitaire, allant de la médecine à la biologie. Alors que le fond détaillé, allant des principes de la catalyse à des modèles théoriques de l’activité enzymatique peut être offert aux élèves à l’aide de conférences et de matériel de lecture, les propriétés des réactions enzymatiques sont mieux comprises par les mains sur l’expérience pratique de enzymes dans l’action comme précédemment démontré2. Ce protocole prévoit un simple à suivre un modèle expérimental permettant de mesurer l’activité enzymatique dans des conditions de laboratoire, à l’aide de lactase à titre d’exemple d’une enzyme dont l’activité pertinente pour la santé et la nutrition humaine.
La lactase glycosidique hydrolase (EC 3.2.1.23/26) est une enzyme nutritionnelles essentielles pour mammifères3. L’activité de la lactase est hautement conservée à travers l’évolution et dérive de la famille des bêta-galactosidase d’enzymes — une famille présente d’ Escherichia coli par le biais d’ Homo sapiens (Figure 1, APB 1JZ8)4. L’importance cruciale de lactase dans un cadre nutritionnel humain provient de son rôle en permettant la dégradation du lactose dans ses éléments constitutifs monosaccharide, qui peuvent ensuite servir à produire de l’énergie dans le corps. La lactase catalyse l’hydrolyse de la liaison glycosidique dans le lactose disaccharides, libérant le galactose et le glucose (Figure 2)5. Ces monosaccharides sont ensuite utilisés principalement pour la production d’adénosine triphosphate (ATP) via le cycle de Krebs et la phosphorylation oxydative6. Pendant le nouveau-né et le développement de l’enfant, la lactase est fortement exprimée dans le système digestif humain, en brisant le lactose provenant du lait maternel, que de lactose, qui est le composant principal hydrates de carbone et l’une des sources principales de la nutrition au cours des premières années 7. l’importance médicale de lactase est soulignée par un déficit en lactase congénitale (CLD), une maladie récessive autosomique rare causée par des mutations dans le gène de la lactase (LCT) codant pour l’ enzyme de lactase8. Nouveaux-nés avec le CLD pièce très petite activité lactasique, donc ils ne peuvent pas être nourris sur le lait maternel, tout autre type de lait, ou une formule contenant du lactose.
Au cours de l’enfance, expression de la lactase est normalement réduite ; Toutefois, cette réduction après le sevrage varie géographiquement, avec environ 35 % des adultes dans le monde entier continue d’exprimer l’ enzyme9. Une expression durable de lactase, connue comme la persistance de la lactase, permet aux gens de continuer à digérer le lait et les produits laitiers d’une variété de sources. À l’inverse, la perte d’expression de la lactase peut conduire à une intolérance au lactose, également connu sous le nom de type adulte hypolactasie (ATH), résultant d’une incapacité à briser le lactose dans l’intestin. ATH est caractérisée par une accumulation jusqu’à de lactose dans le côlon après l’ingestion de lactose contenant des produits alimentaires. Dans le côlon, le lactose accumulé est fermenté par la flore microbienne intestinale, libérant des gaz comme l’hydrogène, le méthane et le dioxyde de carbone. La production de ces gaz chez les individus atteints d’une déficience d’enzyme lactase promouvoir météorisme, flatulence accrue, douleur, nausée et borborygmi (grondement d’estomac)7. Accroissement de la lactose dans le tube digestif peut aussi conduire à des selles molles.
Contrôle de l’expression du gène LCT est modulé par les polymorphismes situés dans les introns du gène MCM6 à proximité. Individus avec une expression durable de lactase porteurs polymorphismes qui fonctionnent comme des améliorateurs distales fortes pour l’expression du gène LCT , compensant ainsi la normale vers le bas de la régulation de la transcription de LCT pendant le sevrage et par conséquent soutenir l’expression de la lactase à l’âge adulte3. Polymorphismes Enhancer ont avancé l’hypothèse d’avoir été sélectionnés positivement après la domestication du bétail et des chameaux au Moyen-Orient il y a plus de cinq mille ans9,10.
Les symptômes résultant de ATH peuvent être gérés en réduisant l’apport en lactose, par exemple en supprimant les produits laitiers provenant de l’alimentation. Une autre approche pour ATH et l’approche de choix pour les CLD, sont l’utilisation de suppléments de lactase, largement disponibles dans les pharmacies. Ces suppléments fournissent lactase isolée de diverses sources, y compris les levures et les bactéries, sous une forme liquide ou de comprimé qui peut être prise avec ou ajoutée au lactose contenant de la nourriture. Le supplément s’hydrolysent une partie du lactose présent dans les aliments aux produits de glucose et de galactose, ainsi permettant leur absorption et prévenir l’accumulation de substrat de lactose non digéré dans l’intestin.
Compte tenu de l’utilisation de suppléments de lactase comme une aide alimentaire, nous avons développé une expérience en laboratoire enzymologie simple adaptée en première année biomedical science ou la pharmacie. Cette expérience de laboratoire tire parti des suppléments de lactase disponibles dans le commerce et usages ortho-nitrophénol –bêta-D-galactopyranoside (ONPG) pour fournir un point de terminaison colorimétrique pour mesurer la rupture des liaisons glycosidiques de lactase ( Figure 3)11. ONPG agit un substrat artificiel de la lactase, qui lorsqu’ils sont soumis à l’hydrolyse de cette enzyme produit D-galactose et ortho-nitrophénol. Ce dernier produit a une couleur jaune, absorbant la lumière à une longueur d’onde de 420 nm. En quantifiant toute modification l’absorbance à 420 qui suit nm l’exposition d’ONPG à la lactase, il est possible d’estimer l’activité de cette enzyme. Cette expérience de laboratoire fournit une démonstration de l’activité enzymatique hydrolase. En construisant en répétitions supplémentaires et effectuer des essais dans des conditions différentes, il est possible d’intégrer des analyses plus sophistiquées de la cinétique enzymatique, fournissant un précieux exemple de vie réelle des enzymes à action pertinente pour la santé humaine.
Protocol
Representative Results
Discussion
Une connaissance approfondie et la compréhension des enzymes, les réactions enzymatiques et cinétique enzymatique est requis pour un large éventail de sujets couvrant la biologie, la pharmacologie et la biomédecine. Le protocole décrit ci-dessus utilise la lactase à titre d’exemple d’une enzyme pertinente pour la santé humaine pour avoir fait preuve de réactions enzymatiques, fournissant des compétences clés qui peuvent être utilisés dans des expériences en laboratoire plus avancés.
Ce protocole a été délibérément conçu pour être aussi robuste que possibles, permettant aux étudiants avec peu ou aucune expérience de laboratoire humide pour produire des résultats interprétables dans un court laps de temps. Durant l’année scolaire à l’école de l’Université de Reading de la pharmacie de 2014/2015, un total de 144 élèves, organisés en groupes de 3, réalisé l’expérience de « mesurer la lactase », avec tous les groupes en mesure de détecter certains niveaux de l’activité enzymatique de comprimés de lactase extraits.
Il y a un certain nombre d’étapes cruciales dans le présent protocole. Tout d’abord, il est essentiel que l’extraction initiale soit efficace, ce qui permet la solubilisation de suffisamment enzyme active pour les analyses suivantes. Dans notre expérience, première année étudiants peuvent atteindre cet objectif en suivant le protocole décrites ; toutefois quelques indications des manifestants de laboratoire était nécessaire à ce stade. Bien qu’il semblerait un point évident en soi, un facteur clé dans la réussite de ce protocole est la capacité à soigneusement mesurer les volumes, correctement étiqueter les tubes et suivez les instructions. Alors qu’un certain niveau de compétence peut être supposé pour beaucoup d’étudiants, une surveillance attentive et une demande de suppression pour les élèves à demander de l’aide dans le cas où ils sont incertains de ce qu’il faut faire fournit ensuite la plus grande probabilité d’un essai réussi.
Évaluation des élèves peut être effectuée par la feuille en classe (disponible sous forme de matériel supplémentaire), demandant aux élèves de noter les données des expériences, commentaire sur leurs résultats et un lien vers informations/lecture de base de matériel de conférence, ou plus détaillées, d’évaluation de classe avec les données de modèle fournies permettant des analyses cinétiques à tenté et à évaluer.
Le protocole présenté ci-après est un exemple simple d’une analyse d’activité de la lactase en vertu des conditions de laboratoire d’enseignement, et il y a amplement l’occasion d’accroître la complexité de l’expérience pour permettre des analyses plus avancés. En particulier, le protocole présenté propose une introduction à la notion de cinétique enzymatique, mais ne permet pas une analyse cinétique des données expérimentales. Par conséquent, nous recommandons Regarde un protocole décrit comme un modèle initial pour les classes, avec les précisions adaptées pour répondre aux objectifs spécifiques et talents de la cohorte d’étudiants entreprise les expériences. Exemples de longues expériences pourraient inclure : mesures à différentes températures, en utilisant des concentrations de substrat différentes pour permettre une analyse statistique, analyse cinétique des données (adaptées aux étudiants/majors de biochimie), commençant par répétées plusieurs différents comprimés et permettre aux étudiants d’évaluer différente activité de l’enzyme dans chacun (avec l’ajout de tablettes de contrôle, adaptés aux étudiants/majors de criminalistique), évaluation de l’impact de la dénaturation par la chaleur ou effectuant des concours expériences par addition de lactose ou inhibiteurs de lactase (tableau 1). Un protocole détaillé pour l’analyse cinétique de lactase a été précédemment publié12.
Une force importante de ce protocole est qu’il combine une introduction de base à l’enzymologie et enzyme cinétique avec une étude de cas réels d’enzymologie en médecine. Ce qui rend ce laboratoire expérience particulièrement importants pour les étudiants en médecine, pharmacie, sciences biomédicales et des questions connexes. Ce qui est important, le fait qu’il y a des fois une maladie sérieuse et un problème alimentaire plus répandu associée du catabolisme de lactose fournit l’occasion d’évoquer un large éventail de questions médicales et éthiques avec les élèves. Cela pourrait inclure les questions entourant les tests génétiques pour les conditions médicales et associés discussions portant sur la thérapie génique et conseil génétique, ainsi que l’utilisation et la vente de suppléments médicinaux. Une limitation majeure est que le protocole ne permet pas une estimation précise de la concentration de l’enzyme, en raison de la matière première utilisée pour l’extraction. Une modification pour tenir compte de ceci, cependant, serait d’utiliser enzyme grade réactif pour le dosage. Ce qui est important, cela permettrait également un calcul plus précis de la cinétique de l’enzyme lactase.
En conclusion, dosage de l’activité de la lactase dans un laboratoire d’enseignement environnement fournit une introduction robuste, attrayante et intéressante au domaine de la biologie de l’enzyme de stade précoce étudiants universitaires.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
PAL a été financée par une maladie de Parkinson UK Research Fellowship (fief F1002). Ce travail a été soutenu par une subvention de recherche enquêteur nouvelles de MRC (MR/L010933/1) et par MRC Programme accorde MR/N026004/1 en PAL et par stagiaire BBSRC BB/M017222/1 à JET. Nous remercions la cohorte 2014-15 du chef partie 1 étudiants à l’Université de Reading, pour avoir participé à la première itération de cette pratique et les suivantes cohortes pour leurs commentaires et la rétroaction.
Materials
| Lactase tablet | Lamberts | 8511-60 | |
| Phosphate buffered saline (powdered) | Sigma | P3813 | Dissolved in deionized water to a final concentration of 100 mM |
| ONPG | Sigma | N1127 | Dissolved in deionized water to a final concentration of 5 mM |
| Sodium Carbonate | Sigma | 451614 | Dissolved in deionized water to a final concentration of 1 M |
| De-ionized water | NA | NA | |
| Pestle and mortar | VWR | ||
| Spectrophotometer | Jenway 6315 | ||
| Pipettes | Gilson | ||
| 15 mL tubes | VWR | ||
| 1.5 mL tubes | Eppendorf | ||
| Spectrophotometer cuvettes | Jenway | ||
| Vortex | Vortex genie 2 | ||
| Centrifuge | Beckman | ||
| Ice bucket | VWR | ||
| Water bath | Thermo-Scientific | ||
| Weighing scales | Thermo-Scientific |
References
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