Misurazione dell'attività enzimatica della lattasi in laboratorio
Summary
L’attività enzimatica della lattasi è essenziale per la lavorazione catabolica del disaccaride lattosio. Qui, l’attività della lattasi trovata negli integratori alimentari è analizzata utilizzando un saggio colorimetrico. Questo fornisce agli studenti una piattaforma sperimentale per comprendere l’attività della lattasi ed enzima cinetica.
Abstract
Comprensione del funzionano di enzimi e concernenti questo esempi di vita reale, è fondamentale per una vasta gamma di corsi di laurea in scienze biologiche e biomediche. Questo facile da seguire protocollo è stato sviluppato per studenti del primo anno dello studente non laureato farmacia e fornisce un’introduzione entry-level di reazioni enzimatiche e procedure analitiche per l’analisi dell’enzima. L’enzima di scelta è la lattasi, come questo rappresenta un esempio di un enzima disponibile commercialmente rilevante per la pratica umana di malattia/farmaceutico. Lattasi è estratta da compresse integratore alimentare e valutata utilizzando un saggio colorimetrico basato su idrolisi di un substrato artificiale per la lattasi (orto-nitrofenolo –beta-D-galattopiranoside, ONPG). Rilascio di orto-nitrofenolo seguendo la scissione idrolitica di ONPG di lattasi è misurata da una variazione di assorbanza a 420 nm e l’effetto della temperatura sulla reazione enzimatica viene valutata effettuando la reazione sul ghiaccio, a temperatura ambiente e a 37 ° C. Analisi più avanzate può essere implementata usando questo protocollo valutando l’attività dell’enzima in condizioni diverse e utilizzando reagenti diversi.
Introduction
Gli enzimi sono un tipo specializzato di proteine che agiscono come catalizzatori biologici per reazioni chimiche nel vivere organismi1. L’azione degli enzimi è fondamentale per la vita, fornendo energia, smaltimento dei rifiuti e permettendo di organismi a funzionare. Enzimi di comprensione è, quindi, fondamentale per una piena comprensione della vita. Tale conoscenza è essenziale per un’ampia varietà di programmi di laurea universitari, che vanno dalle scienze mediche alla biologia. Mentre uno sfondo dettagliato dai principi di catalisi ai modelli teorici dell’attività enzimatica può essere fornito agli studenti mediante lezioni e materiale di lettura, le proprietà delle reazioni enzimatiche sono meglio compreso da mani su esperienza pratica di gli enzimi in azione come precedentemente dimostrato2. Questo protocollo fornisce una semplice seguire il paradigma sperimentale per misurare l’attività dell’enzima in condizioni di laboratorio, utilizzando lattasi come esempio di un enzima con un’attività rilevante per la salute e la nutrizione umana.
La lattasi glicosidici idrolasi (EC 3.2.1.23/26) è un enzima di centrale importanza nutrizionale per mammiferi3. L’attività della lattasi è una proteina altamente conservata attraverso l’evoluzione e deriva dalla famiglia degli enzimi beta-galattosidasi — una famiglia presente da Escherichia coli attraverso a Homo sapiens (Figura 1, PDB 1JZ8)4. L’importanza critica della lattasi in un ambiente nutrizionale umano deriva dal suo ruolo nel permettere la ripartizione di lattosio nei suoi componenti costitutivi monosaccaride, che possono quindi essere utilizzati per generare energia nel corpo. Lattasi catalizza l’idrolisi del legame glicosidico nel disaccaride lattosio, rilasciando galattosio e glucosio (Figura 2)5. Questi monosaccaridi vengono quindi utilizzati principalmente per la produzione di adenosina trifosfato (ATP) attraverso il ciclo dell’acido citrico e fosforilazione ossidativa6. Durante lo sviluppo infantile e neonato, lattasi è altamente espressa nell’apparato digerente umano, lattosio ricevuto dal latte materno che di cui lattosio è il componente primario del carboidrato e una delle principali fonti di nutrizione durante i primi anni 7. l’importanza medica di lattasi è evidenziata da deficit congenito di lattasi (CLD), uno stato recessivo autosomal raro causato dalle mutazioni nel gene della lattasi (LCT) che codifica per l’ enzima lattasi8. Neonati con CLD esibiscono l’attività della lattasi molto poco, quindi non possono essere alimentati con il latte materno, qualsiasi altro tipo di latte, o una formula contenente lattosio.
Durante l’infanzia, l’espressione della lattasi è normalmente ridotta; Tuttavia, questa riduzione dopo lo svezzamento varia geograficamente, con circa il 35% di adulti in tutto il mondo continua ad esprimere l’ enzima9. Sostenuta espressione della lattasi, nota come persistenza di lattasi, consente alle persone di continuare a digerire il latte e derivati da una gamma di fonti. Al contrario, la perdita di espressione di lattasi può comportare l’intolleranza al lattosio, noto anche come adulto-tipo hypolactasia (ATH), risultanti da un’incapacità di scomporre il lattosio nell’intestino. ATH è caratterizzata da una build up di lattosio nel colon dopo ingestione di lattosio contenenti prodotti alimentari. Nel colon, il lattosio accumulato viene fermentato da fauna microbica dell’intestino, rilasciando gas tra cui l’idrogeno, metano e anidride carbonica. Gonfiore addominale, flatulenza aumentata, dolore, nausea, borborigmi (brontolio di stomaco)7e promuovere la produzione di questi gas in individui con deficit di enzima lattasi. Aumento dei livelli di lattosio nell’apparato digerente può anche portare alla perdita di feci.
Il controllo dell’espressione genica LCT è modulato da polimorfismi localizzati in introni del gene MCM6 nelle vicinanze. Gli individui con sostenuta espressione della lattasi trasportano polimorfismi che fungono da rinforzatori distali forti per LCT espressione genica, compensando così la normale regolazione della trascrizione di LCT durante lo svezzamento e di conseguenza sostenere l’espressione della lattasi in età adulta3. Polimorfismi di Enhancer sono stati suggeriti per sono stati selezionati positivamente dopo l’addomesticamento dei bovini e dei cammelli in Medio Oriente oltre cinquemila anni fa9,10.
I sintomi che derivano da ATH possono essere gestiti riducendo l’assunzione di lattosio, ad esempio rimuovendo i latticini dalla dieta. Un approccio alternativo per ATH e l’approccio di scelta per CLD, è l’uso di integratori di lattasi, ampiamente disponibili in farmacia. Questi integratori forniscono lattasi isolata da una varietà di fonti, compresi i lieviti e batteri, in forma liquida o basati su pillola che può essere presa con o aggiunto al lattosio contenenti alimenti. Il supplemento sarà idrolizzare una percentuale del lattosio presente nel cibo ai prodotti glucosio e galattosio, così permettendo il loro assorbimento e accumulo di substrato di lattosio non digerito nell’intestino.
Basata sull’utilizzo di integratori di lattasi come aiuto dietetico, abbiamo sviluppato un esperimento di laboratorio di enzimologia semplice adatto per studenti primo anno biomedicali scienza o farmacia. Questo esperimento di laboratorio si avvale di integratori di lattasi commercialmente disponibili e usi orto-nitrofenolo –beta-D-galattopiranoside (ONPG) per fornire un punto di fine colorimetrico per la misurazione la scissione dei legami glicosidici di lattasi ( Figura 3)11. ONPG agisce un substrato artificiale per la lattasi, che quando sottoposto a idrolisi da questo enzima produce D-galattosio e orto-nitrofenolo. Quest’ultimo prodotto ha un colore giallo, assorbendo la luce ad una lunghezza d’onda di 420 nm. Di quantificare eventuali modifiche di assorbanza a seguito di 420 nm l’esposizione di ONPG per lattasi, è possibile valutare l’attività di questo enzima. Questo esperimento di laboratorio fornisce una dimostrazione dell’attività enzimatica idrolasi. Costruendo in ulteriori repliche e svolgimento di analisi in condizioni diverse, è possibile incorporare più sofisticate analisi di cinetica enzimatica, fornendo un prezioso esempio di vita reale degli enzimi in azioni rilevanti per la salute umana.
Protocol
Representative Results
Discussion
Una dettagliata conoscenza e comprensione degli enzimi, le reazioni enzimatiche e cinetica degli enzimi è necessaria per una vasta gamma di argomenti che abbracciano la biologia, la biomedicina e la farmacologia. Il protocollo descritto sopra utilizza lattasi come un esempio di un enzima rilevante per la salute umana per aver manifestato reazioni enzimatiche, fornendo competenze chiave che possono essere utilizzate in esperimenti di laboratorio più avanzati.
Questo protocollo è stato volutamente progettato per essere affidabile quanto possibili, permettendo agli studenti con poca o nessuna esperienza di laboratorio bagnato di produrre risultati interpretabili in un breve lasso di tempo. Nell’anno accademico 2014/2015 presso la facoltà di farmacia dell’Università di Reading, un totale di 144 studenti, organizzati in gruppi di 3, ha svolto l’esperimento “misurazione della lattasi”, con tutti i gruppi in grado di rilevare un certo livello di attività enzimatica dal tablet di lattasi estratti.
Ci sono un numero di punti critici in questo protocollo. In primo luogo, è essenziale che l’estrazione iniziale è efficiente, consentendo di solubilizzazione di abbastanza enzima attivo per analisi successive. Nella nostra esperienza, primo anno gli studenti universitari possono farlo seguendo il protocollo come indicato; Tuttavia alcune indicazioni da manifestanti di laboratorio è stato richiesto a questo punto. Anche se sembrerebbe un punto evidente, un fattore chiave per il successo di questo protocollo è la capacità di misurare volumi, correttamente Etichettare provette e seguire attentamente le istruzioni. Mentre un certo livello di competenza può essere presupposto per molti studenti, attento monitoraggio e una chiara richiesta per gli studenti a chiedere assistenza nel caso in cui non sono sicuri di cosa fare successivamente fornisce la probabilità più grande di un test di successo.
Valutazione degli studenti può essere effettuata dalla classe foglio di lavoro (disponibile come materiale supplementare), chiedendo agli studenti di notare dati dagli esperimenti, commento sui loro risultati e link a informazioni/letture da materiale lezione, o da più dettagliata, dalla valutazione di classe con i dati del modello forniti consentendo analisi cinetiche essere tentato e valutati.
Il protocollo presentato qui è un semplice esempio di un analisi di attività della lattasi sotto condizioni di laboratorio di insegnamento, e c’è ampia possibilità di aumentare la complessità dell’esperimento per consentire analisi più avanzate. In particolare, il protocollo presentato viene fornita un’introduzione al concetto di cinetica enzimatica ma non consente l’analisi cinetica dei dati sperimentali. Come tale, vi consigliamo di visualizzare il protocollo descritto come un modello iniziale per le classi, con dettagli precisi adattati per soddisfare gli obiettivi specifici e talenti della coorte studente impresa gli esperimenti. Esempi di esperimenti estesi possono includere: ripetute misure a temperature diverse, utilizzando concentrazioni di substrato differenti per consentire analisi statistica, analisi cinetica dei dati (adatti per gli studenti di biochimica/Major), iniziando con diversi tablet differenti e consentendo agli studenti di valutare diverse attività dell’enzima in ciascuna (con l’aggiunta di control compresse, adatti per gli studenti/specializzandi di scienze forensi), valutando l’impatto della denaturazione al calore o svolgimento concorso esperimenti di aggiunta di lattosio o inibitori della lattasi (tabella 1). Un protocollo dettagliato per l’analisi cinetica di lattasi precedentemente è stato pubblicato12.
Un importante punto di forza di questo protocollo è che esso combina un’introduzione di base alla cinetica di enzimologia ed enzima con un caso di studio reale di enzimologia in medicina. Questo rende questo laboratorio esperimento di particolare rilevanza per gli studenti di medicina, farmacia, scienze biomediche e argomenti correlati. Soprattutto, il fatto che c’è una grave condizione medica e un più diffuso problema dietetico associato con catabolismo del lattosio offre l’opportunità di raccogliere una vasta gamma di questioni mediche ed etiche con gli studenti. Questo potrebbe includere le questioni che circondano la prova genetica per condizioni mediche e associate discussioni relative alla terapia genica e counselling genetico, così come uso e vendita di medicinali integratori. Uno dei principali limiti è che il protocollo non consentono una stima precisa della concentrazione di enzimi, a causa del materiale di partenza utilizzato per l’estrazione. Una modifica per tenere conto di questo, tuttavia, sarebbe quella di utilizzare degli enzimi di grado reagente per il dosaggio. D’importanza, questo permetterebbe anche per un calcolo più preciso della cinetica per l’enzima lattasi.
In conclusione, analizzando l’attività della lattasi in un laboratorio di insegnamento ambiente fornisce una robusta, coinvolgente e interessante introduzione al campo della biologia di enzima per fase iniziale gli studenti universitari.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
PAL è stato finanziato da un Parkinson UK Research Fellowship (grant F1002). Questo lavoro è stato supportato da un MRC nuovo investigatore Research Grant (MR/L010933/1) e dal programma MRC concede MR/N026004/1 a PAL e da studentship BBSRC BB/M017222/1 a JET. Vi ringraziamo della coorte 2014-15 MPharm parte 1 studenti all’Università di Reading per aver preso parte nella prima iterazione di questo pratico e successive coorti per loro feedback e input.
Materials
| Lactase tablet | Lamberts | 8511-60 | |
| Phosphate buffered saline (powdered) | Sigma | P3813 | Dissolved in deionized water to a final concentration of 100 mM |
| ONPG | Sigma | N1127 | Dissolved in deionized water to a final concentration of 5 mM |
| Sodium Carbonate | Sigma | 451614 | Dissolved in deionized water to a final concentration of 1 M |
| De-ionized water | NA | NA | |
| Pestle and mortar | VWR | ||
| Spectrophotometer | Jenway 6315 | ||
| Pipettes | Gilson | ||
| 15 mL tubes | VWR | ||
| 1.5 mL tubes | Eppendorf | ||
| Spectrophotometer cuvettes | Jenway | ||
| Vortex | Vortex genie 2 | ||
| Centrifuge | Beckman | ||
| Ice bucket | VWR | ||
| Water bath | Thermo-Scientific | ||
| Weighing scales | Thermo-Scientific |
References
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