Laktaz enzim etkinliğin ölçülmesi öğretim laboratuarında
Summary
Laktaz enzim aktivitesinin disaccharide laktoz katabolik işleme için gereklidir. Burada, diyet takviyeleri bulunan laktaz aktivitesi kolorimetrik bir tahlil kullanılarak denenecektir. Bu deneysel bir platformla laktaz ve enzim kinetiği etkinliğini anlamak için öğrencilere sağlar.
Abstract
Enzimlerin çalışma şeklini anlamak ve bu gerçek hayattan örnekler için ilgili biyolojik ve Biyomedikal Bilimleri lisans dereceleri geniş bir yelpazesi için önemlidir. Bu takip edilmesi kolay iletişim kuralı ilk yıl lisans eczane öğrenciler için geliştirilmiş ve enzim analizi için enzim reaksiyonları ve analitik işlemleri giriş seviyesi bir giriş sağlar. Bu piyasada bulunan enzim insan hastalık/ilaç uygulama için ilgili bir örnek gösterir gibi seçim laktaz, enzimdir. Laktaz besin takviyesi tabletler ayıklanır ve laktaz için yapay bir substrat hidroliz dayanan kolorimetrik bir tahlil kullanarak değerlendirildi (ortho-nitrophenol –beta-D-galactopyranoside, ONPG). Orto-nitrophenol ONPG hydrolytic bölünme laktaz tarafından takip sürümü değişiklik 420 absorbans ile ölçülen nm ve sıcaklık etkisi enzimatik reaksiyon reaksiyon buz, oda sıcaklığında ve 37 gerçekleştirerek değerlendirilir ° C. Daha gelişmiş analiz enzim etkinliği farklı koşullar altında değerlendirilmesi ve farklı reaktifler kullanarak bu protokolü kullanarak uygulanabilir.
Introduction
Özel bir tür yaşam vücudunda kimyasal reaksiyonlar için biyolojik katalizör görevi protein enzimlerdir organizmalar1. Enzimler, kaybı atılması ve organizmaların çalışması izin enerji sağlayan hayat için önemli bir eylemdir. Anlayış enzimler önemlidir, bu nedenle, hayat tam bir anlayış. Böyle bir bilgiye Tıp Bilimleri biyoloji Üniversitesi seviye derecesi programları, geniş bir yelpazesi için esastır. Kataliz ilkeleri enzim aktivitesinin teorik modeller arasında değişen ayrıntılı bir arka plan için öğrencilerin ders kullanarak ve malzeme okuma sağlanabilir iken, enzim reaksiyonları özelliklerini en iyi pratik deneyimi üzerinde eller tarafından anlaşılan enzimler eylem daha önce2gösterdi. Bu iletişim kuralı Laktaz enzim ile insan beslenme ve sağlık ile ilgili etkinlik örneği olarak kullanarak laboratuvar koşullarında enzim etkinliği ölçmek için deneysel paradigma izleyin kolay sağlar.
Glycosidic hidrolaz laktaz (AK 3.2.1.23/26) memeliler3için merkezi beslenme önemli bir enzimdir. Laktaz aktivitesi evrim son derece korunmuş ve enzimler beta galaktozidaz aileden gelen türetir — bir aile Homo sapiens (1 rakam, PDB 1JZ8)4‘ e Escherichia coli gelen mevcut. Daha sonra vücutta enerji üretmek için kullanılabilir kurucu yaşam bileşenlerinden içine laktoz dökümü izin rolüne laktaz bir insan beslenme ortamda kritik önemini kaynaklanmaktadır. Laktaz tromboksan hidroliz galaktoz ve glikoz (Şekil 2) serbest disaccharide laktoz glycosidic Bond5. Bu bol daha sonra öncelikle nesil adenozin trifosfat (ATP) üzerinden sitrik asit döngüsü ve Oksidatif fosforilasyon6için kullanılır. Yenidoğan ve bebek gelişimi sırasında laktaz son derece insan sindirim sistemi, anne sütü hangi laktoz birincil karbonhidrat bileşeni ve beslenme en önemli kaynaklarından biridir ilk yıllarında alınan laktoz aşağı kırma olarak ifade edilir 7. konjenital laktaz eksikliği (CID), nadir otozomal resesif koşulu laktaz gen (LCT) için Laktaz enzim8kodlama mutasyonlar neden laktaz tıbbi önemi vurgulanır. Yeni doğmuş bebekler suç araştırma departmanı ile çok az laktaz aktivitesi sergi, böylece onlar meme süt, süt ya da laktoz içeren formül başka tür beslenen olamaz.
Çocukluk çağında laktaz ifade normalde azalır; Ancak, bu azaltma sütten kesme takip coğrafi olarak, yaklaşık yetişkin enzim9ifade etmek dünya çapında devam eden % 35 ile değişir. Laktaz kalıcı bilinen laktaz, sürekli ifade bireyler süt ve süt ürünleri kaynakları bir dizi sindirmek devam etmek izin verir. Diğer taraftan, laktaz ifade kaybı laktoz intoleransı, olarak da bilinen yetişkin tipi hypolactasia (ATH), laktoz gut yıkmak için bir yetersizlik nedeniyle yol açabilir. ATH bir yapı tarafından yukarı laktoz laktoz gıda ürünleri içeren sindirim takip kolon ile karakterizedir. Kolon, bağırsak mikrobiyal fauna hidrojen, metan ve karbon dioksit gibi gazlar serbest tarafından birikmiş laktoz fermente. Laktaz enzim eksiklikleri ile bireylerde bu gazların üretimi teşvik abdominal şişkinlik, artan şişkinlik, ağrı, bulantı ve borborygmi (karın guruldama)7. Laktoz sindirim sistemi içinde daha yüksek düzeyde de gevşek dışkı neden olabilir.
LCT gen ekspresyonu kontrolünü yakındaki MCM6 gen intron içinde bulunan polimorfizmleri tarafından modüle. Laktaz sürekli ifade olan bireyler böylece normal sütten kesme sırasında LCT transkripsiyon aşağı karşılayan güçlü distal arttırıcılar LCT gen ifade olarak işlev polimorfizmleri taşımak ve sonuç olarak yetişkinlik3ifadede laktaz sürdürülmesi. Olumlu evcilleştirme, sığır ve deve Orta Doğu’daki aşağıdaki beş bin yıl önce seçilmiştir için önerilen artırıcı polimorfizmleri9,10.
ATH–dan kaynaklanan belirtiler laktoz alımı, örneğin diyet süt ürünleri kaldırarak azaltarak yönetilebilir. ATH için alternatif bir yaklaşım ve CID için tercih edilen yaklaşım laktaz takviyeleri, eczanelerden yaygın olarak kullanılan kullanmaktır. Bu takviyeleri laktaz kaynakları, mantar ve bakteri, ile çekilen veya gıda içeren laktoz eklenen bir sıvı veya hap tabanlı form dahil olmak üzere çeşitli izole sağlar. Ek laktoz mevcut gıda glikoz ve galaktoz ürünleri, böylece kendi emilimi erişimine izin verme ve sindirilmemiş laktoz substrat gut birikimi engelleyen bir kısmı hidrolize.
Laktaz takviyeleri diyet bir yardım olarak kullanmak dayanarak, biz ilk yıl Biyomedikal Bilim veya eczane öğrenciler için uygun bir basit Enzimologiya laboratuvar deneyi geliştirdik. Bu laboratuvar deneyi, piyasada bulunan laktaz takviyeleri ve kullanımları ortho yararlanır-nitrophenol –beta-D-galactopyranoside (ONPG) ( laktaz tarafından bölünme glycosidic tahvil ölçmek için kolorimetrik bir bitiş noktası sağlamak için Şekil 3)11. ONPG davranır laktaz için yapay bir substrat olan bu enzim tarafından hidroliz tabi D-galaktoz ve Orto-nitrophenol üretir. İkinci ürün bir dalga boyu 420, ışık emici sarı bir renge sahiptir nm. 420 nm şu absorbans herhangi bir değişiklik miktarının tarafından ONPG maruz kalma laktaz, bu enzim aktivitesini tahmin etmek mümkündür. Bu laboratuvar deneyi enzimatik hidrolaz etkinlik gösterimini sağlar. Ek çoğaltır bina ve farklı koşullarda deneyleri yürüten, enzim kinetiği, değerli bir gerçek hayattan örnek eylem insan sağlığı için ilgili enzimlerin sağlayan daha gelişmiş analiz dahil etmek mümkündür.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detaylı bilgi ve anlayış enzim, Enzimatik reaksiyonları ve enzim kinetiği biyoloji, biyomedikal ve farmakoloji kapsayan konular geniş bir yelpazesi için gerekli. Yukarıda açıklanan protokol Laktaz enzim insan sağlığı için ilgili bir örnek olarak daha gelişmiş laboratuar tabanlı deneylerde kullanılan anahtar becerileri sağlayarak enzimatik reaksiyonlar gösteren için kullanır.
Bu iletişim kuralı kasıtlı olarak yorumlanabilir sonuçları kısa bir alanda üretmek için az veya hiç ıslak laboratuvar deneyimi mümkün, izin öğrenciler olarak sağlam olması için dizayn edilmiştir. Reading Üniversitesi School of eczane 2014/2015 öğretim yılında toplam 144 öğrenci 3, gruplar halinde düzenlenmiş, tüm grupları belli bir düzeyde laktaz tabletten enzimatik aktivite tespit etmek mümkün ile “laktaz ölçme” deneme yürüttü ayıklar.
Bu protokol önemli adımlar vardır. İlk olarak, ilk çıkarma verimli, daha sonraki analizler için yeterince etkin enzim solubilization izin önemlidir. Deneyim, ilk yıl lisans öğrencileri bu özetlenen iletişim kuralı takip ederek elde edebilirsiniz; Ancak bazı rehberlik laboratuvar göstericiler gelen bu noktada gerekli oldu. Bu çok aşikar bir nokta gibi görünüyor olsa da, bu protokol başarısında önemli bir faktör dikkatle birimleri ölçmek, doğru tüpler etiket ve yönergeleri izleyin yeteneğidir. Yeterlilik belirli bir düzeyde çok sayıda öğrenci, dikkatli izleme ve öğrencilerin onlar değilseniz durumunda yardım için sormak açık bir istek için kabul edilebilir ne yapacağımı sonraki en büyük başarılı bir tahlil olasılığını sağlar.
Öğrenci değerlendirme deneyler, yorum onların sonuçları ve arka plan bilgi/okuma bağlantı ders malzemesinden verilerden dikkat edilmesi gereken öğrenciler soran sınıfının çalışma sayfası (ek malzeme olarak kullanılabilir), veya daha fazla tarafından yürütülen olabilir ayrıntılı sınıf değerlendirmesi ile sağlanan modeli veri kinetik analizler için çalıştı ve değerlendirilmesi için izin dışarı.
Burada sunulan protokolü bir laktaz aktivitesi tahlil öğretim laboratuvar koşulları altında basit bir örneğidir ve bol bol fırsat daha gelişmiş analizler izin için deney karmaşıklığını artırmak için. Özellikle, sunulan Protokolü enzim kinetiği kavramı bir giriş sağlar ancak deneysel veriler kinetik analizi için izin vermez. Bu nedenle, biz açıklanan protokolü ile ilgilenen özel amaçları ve deneyler taahhüt öğrenci kohort yeteneklerini uygun şekilde adapte kesin detayları ile sınıflar için ilk bir şablon olarak tavsiye ederim. Genişletilmiş deneyler örnekler: tekrarlanan ölçümleri istatistiksel analizi, ile başlayan kinetik, veri çözümlemesi (Biyokimya öğrenciler/majors için uygun) izin vermek için farklı substrat konsantrasyonu kullanarak farklı sıcaklıklarda birkaç farklı tablet ve farklı her (kontrol tabletler, adli tıp öğrencileri/majors için uygun eklenmesiyle) enzim aktivitesinin değerlendirmek öğrenciler, ısı denatürasyon etki değerlendirme veya rekabeti taşıyan laktoz eklenmesi veya laktaz (Tablo 1) inhibitörleri deneyler. Detaylı bir protokol laktaz kinetik analizi için daha önce yayımlanmış12oldu.
Bu protokol önemli bir gücü bu Enzimologiya tıpta bir gerçek vaka çalışması ile Enzimologiya ve enzim kinetiği temel bir giriş birleştirir kaldı. Bu bu laboratuvar yapar deneme ilaç, eczane, biyomedikal Bilimler ve ilgili konuları öğrencilere belirli konu ile ilgili. Önemlisi, ciddi bir tıbbi durumun ve daha yaygın bir diyet sorunu laktoz katabolizma ile ilişkili olduğu gerçeğini çok çeşitli tıbbi ve etik sorunları ile öğrenciler yetiştirmek için fırsat sağlar. Bu gen terapisi ve genetik danışmanlık, hem de kullanımı ve Satılık tıbbi ilave için ilgili tartışmalar ilgili ve tıbbi durumlar için genetik test çevre sorunları içerebilir. Bir büyük protokolü çıkarma için kullanılan başlangıç malzeme nedeniyle enzim konsantrasyon kesin tahmini için izin değil kısıtlamadır. Bunun için hesap için bir değişiklik ancak, reaktif sınıf enzim tayini için kullanmak olacaktır. Önemlisi, bu da kinetik Laktaz enzim için daha kesin hesaplanması için sağlayacak.
Sonuç olarak, etkinliğin raporlaması laktaz bir öğretim laboratuvarda, ortamı bir sağlam, ilgi çekici ve ilginç giriş alanı enzim Biyoloji erken evre için üniversite öğrencileri niteliğindedir.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
DOSTUM bir Parkinson İngiltere’de araştırma bursu (grant F1002) tarafından finanse edildi. Bu eser bir MRC yeni araştırmacı araştırma hibe tarafından (Bay/L010933/1) desteklenen bir durumdu ve PAL için ve BBSRC öğrencilik BB/M017222/1-JET tarafından Bay/N026004/1 MRC programı tarafından verin. 2014-15 kohort MPharm Bölüm 1 öğrencilerin üniversite okuma geribildirim ve giriş için bu pratik ve sonraki tabur ilk yinelemesi katılan için teşekkür ediyoruz.
Materials
| Lactase tablet | Lamberts | 8511-60 | |
| Phosphate buffered saline (powdered) | Sigma | P3813 | Dissolved in deionized water to a final concentration of 100 mM |
| ONPG | Sigma | N1127 | Dissolved in deionized water to a final concentration of 5 mM |
| Sodium Carbonate | Sigma | 451614 | Dissolved in deionized water to a final concentration of 1 M |
| De-ionized water | NA | NA | |
| Pestle and mortar | VWR | ||
| Spectrophotometer | Jenway 6315 | ||
| Pipettes | Gilson | ||
| 15 mL tubes | VWR | ||
| 1.5 mL tubes | Eppendorf | ||
| Spectrophotometer cuvettes | Jenway | ||
| Vortex | Vortex genie 2 | ||
| Centrifuge | Beckman | ||
| Ice bucket | VWR | ||
| Water bath | Thermo-Scientific | ||
| Weighing scales | Thermo-Scientific |
References
- Berg, J. M., Tymoczko, J. L., Gatto, J. G., Stryer, L. . Biochemistry. , (2015).
- Jittam, P., et al. Red seaweed enzyme-catalyzed bromination of bromophenol red: An inquiry-based kinetics laboratory experiment for undergraduates. Biochemistry and Molecular Biology Education. 37, 99-105 (2009).
- Troelsen, J. T. Adult-type hypolactasia and regulation of lactase expression. Biochimica et biophysica acta. 1723, 19-32 (2005).
- Juers, D. H., et al. A structural view of the action of Escherichia coli (lacZ) beta-galactosidase. Biochemistry. 40, 14781-14794 (2001).
- Plimmer, R. H. On the presence of lactase in the intestines of animals and on the adaptation of the intestine to lactose. Journal of Physiology. 35, 20-31 (1906).
- Krebs, H. A., Salvin, E., Johnson, W. A. The formation of citric and alpha-ketoglutaric acids in the mammalian body. The Biochemical journal. 32, 113-117 (1938).
- Vesa, T. H., Marteau, P., Korpela, R. Lactose intolerance. Journal of the American College of Nutrition. 19, 165S-175S (2000).
- Robayo-Torres, C. C., Nichols, B. L. Molecular differentiation of congenital lactase deficiency from adult-type hypolactasia. Nutrition Reviews. 65, 95-98 (2007).
- Swallow, D. M. Genetics of lactase persistence and lactose intolerance. Annual Review of Genetics. 37, 197-219 (2003).
- Enattah, N. S., et al. Independent introduction of two lactase-persistence alleles into human populations reflects different history of adaptation to milk culture. American Journal of Human Genetics. 82, 57-72 (2008).
- Lowe, G. H. The rapid detection of lactose fermentation in paracolon organisms by the demonstration of beta-D-galactosidase. Journal of Medical Laboratory Technology. 19, 21-25 (1962).
- Russo, S. F., Moothart, L. Kinetic study of the Enzyme Lactase. Journal of Chemical Education. 63, 242 (1986).
