Transkripsiyon Faktörleri ile fare embriyonik fibroblastlar yeniden programlama bir Hemogenic Programı tetikleyebilecek
Summary
The protocol described here details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts via overexpression of a minimal set of transcription factors. This technology may be translated to the human system to provide platforms for future study of hematopoiesis, hematologic disease, and hematopoietic stem cell transplant.
Abstract
This protocol details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) via overexpression of transcription factors (TFs). We first designed a reporter screen using MEFs from human CD34-tTA/TetO-H2BGFP (34/H2BGFP) double transgenic mice. CD34+ cells from these mice label H2B histones with GFP, and cease labeling upon addition of doxycycline (DOX). MEFS were transduced with candidate TFs and then observed for the emergence of GFP+ cells that would indicate the acquisition of a hematopoietic or endothelial cell fate. Starting with 18 candidate TFs, and through a process of combinatorial elimination, we obtained a minimal set of factors that would induce the highest percentage of GFP+ cells. We found that Gata2, Gfi1b, and cFos were necessary and the addition of Etv6 provided the optimal induction. A series of gene expression analyses done at different time points during the reprogramming process revealed that these cells appeared to go through a precursor cell that underwent an endothelial to hematopoietic transition (EHT). As such, this reprogramming process mimics developmental hematopoiesis “in a dish,” allowing study of hematopoiesis in vitro and a platform to identify the mechanisms that underlie this specification. This methodology also provides a framework for translation of this work to the human system in the hopes of generating an alternative source of patient-specific hematopoietic stem cells (HSCs) for a number of applications in the treatment and study of hematologic diseases.
Introduction
Hematopoiezis hematopoetik kök hücreler (HSC) bu tür Aort-Gonad-mesonephros olarak embriyonik hematopoetik siteleri ve plasenta 1,2 çeşitli mevcut hemogenic endotel kapalı tomurcuk karmaşık bir gelişimsel süreçtir. In vitro olarak kültürü HSCler yetersizlik bu işlemin derinlemesine analizi gibi, bu çalışmaların klinik uygulama önler. Bu sınırlamayı aşmak için, daha önceki çalışmalar elde girişiminde HSCler de novo da yeniden programlama ortamı 4,5 kullanarak pluripotent kök hücreler (PSC) 3 veya somatik hücrelerinde olduğu plastikliği ve yönlendirilmiş farklılaşma farklılaşması ile. Ancak bu çalışmalar, klinik güvenli engraftable hücreleri oluşturmak veya kesin gelişimsel hemopoeziste çalışma izin vermez "bir tabak."
somatik fibroblastlar p gelen Yamanaka ve arkadaşları tarafından kurulan yeni iş kaynaklı üretmek için pluripotent kök hücreler (iPSCs)Transkripsiyon faktörü (TF) yeniden programlama hücre kaderine 6,7 göre aşırı stratejileri için bir çerçeve rovides. Bu eser kolayca elde somatik hücre TF reprogramming yoluyla seçim hücre tipleri oluşturmak için çeşitli alanlarda araştırmacılara yol açtı. Burada anlatılan yeniden programlama stratejisinin amacı fare somatik in vitro insan hematopoez incelemek için hastaya özgü fibroblastlar yeniden programlamak için insan sisteme bu bulguları tercüme amacı ile TF tabanlı yeniden programlama yaklaşımını kullanarak hücreleri ve bir hemogenic süreci teşvik etmek hastalık modelleme, ilaç testi için hastaya özgü kan ürünlerini üretmek ve kök hücre nakli.
Bu fare sistemdeki uygun yeniden programlama sağlamak için ilk adım CD34 ifadesi, endotelyal progenitör hücrelerin ve HKH'lerin bilinen bir işaretleyici için bir okuma-out olarak görev yapan bir muhabir hattı geliştirmekti. Bunu yapmak için, huCD34-TTA teto-H2BGFP transgenik fare hattı g kullanılmıştırenerate çift transgenik fare embriyonik fibroblastlar (MEFS), şimdi CD34 promotör 8 aktivasyonu üzerine yeşil floresan 34 / H2BGFP, ifade etti. Bu hematopoietik tarifnamede ve gelişme sırasında farklı noktalarda gerekli olduğu bilinmektedir TFs çeşitli tarama sağladı. PMX retrovial vektörleri 18 TFs ile başlayarak 34 / H2BGFP MEFS AFT024 stromal hücreler HSC destekleyen tüm faktörler ve kültürlü transduced, (34 / H2BGFP fareler açıklanan literatür madencilik ve daha önce gelen HKH'lerin istinat GFP etiketin profil aracılığıyla belirlenir). muhabir aktivasyonu için TFs optimal set tespit edilene kadar 34 / H2BGFP aktivasyon algıladıktan sonra, TF sonradan yeniden programlama kokteyli çıkarıldı. Bu ilk taramayla sonra faktörler TFS kontrol ekspresyonunu sağlamak için DOX uyarılabilir pFUW vektör sistemine aktarılmıştır. Bu iki DOX kontrol sistemi (34 / H2BGFP hücreleri ve pFUW uyarılabilir vektörleri), gelen MEF'ler uyumlu olduğuvahşi tip C57BL / 6 fareleri gerekmiştir. Hemogenesis devam ve mültilineaj clonogenic atalarıdır oluşturmak için izin veren uygun bir mikro sağlamak için de gerekliydi.
Hematopoetik kök ve progenitör hücreler içine (HSPCs) somatik hücre yeniden programlamak için çalışırken Güncel çalışmalar başarı 9-11 değişik düzeylerde bir araya geldi. Bugüne kadar, fare ve uzun vadeli ve kendini sürekli yenileyen repopulating yeteneği ile insan transplante HSPCs hem nesil TFs aynı seti kullanılarak elde edilmemiştir. Bu protokol, biz tekrarlanabilir MEFS içinde hemogenesis ikna etmek için daha önce kurulmuş stratejinin ayrıntılı bir açıklamasını sağlar. Bu TFs (Gata2, Gfi1b cFos ve Etv6) en az bir setinin giriş göstermektedir gelişim hematopoez ve hematopoietik yeniden programlama klinik uygulamasının 12 incelenebilir hangi bir platform sağlar in vitro bir karmaşık gelişim programı tahrik edebilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Generating HSPCs de novo from easily attainable somatic cells offers a unique method to study hematopoiesis in vitro, and the opportunity to potentially apply this technology to the human system. This translation would generate a new tool to study human hematologic disease in a dish, as well as provide drug testing platforms and gene targeting opportunities to treat numerous disorders with novel therapeutics or HSC transplants. In the field, recent studies have expanded on the ability to generate HSPCs …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by an NHLBI grant to K.M. and I.R.L. (1RO1HL119404). Carlos-Filipe Pereira was the recipient of a Revson Senior Biomedical Fellowship. We gratefully acknowledge the Mount Sinai hESC/iPSC Shared Resource Facility and S. D’Souza for assistance with materials and protocols. We also thank the Mount Sinai Flow Cytometry, Genomics, and Mouse facilities.
Materials
| DMEM | Invitrogen | 11965-092 | |
| 0.45uM filters | Corning | 430625 | |
| Amicon Ultra centrifugal filters | Millipore | UFC900324 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030-081 | |
| FBS | Gemini's Benchmark | 100-106 | |
| PBS | Life Technologies | 14190-144 | |
| 18G needles | BD | 305195 | |
| 20G needles | BD | 305175 | |
| 25G needles | BD | 305125 | |
| Collagenase Type I | Sigma | C0130-100MG | |
| TrypLE Express | Invitrogen | 12605-010 | |
| Myelocult media | Stem Cell Technologies | M5300 | |
| SCF | R & D Systems | 455-MC | |
| Flt3L | R & D Systems | 427-FL | |
| IL-3 | R & D Systems | 403-ML | |
| IL-6 | R & D Systems | 406-ML | |
| TPO | R & D Systems | 488-TO | |
| Doxycycline | Sigma | D9891-1G | |
| Polybrene (hexadimethrine bromide) | Sigma | AL-118 | |
| Durapore 0.65uM membrane filters | Millipore | DVPP14250 | |
| Methylcellulose media | Stem Cell Technologies | Methocult M3434 | |
| Hydrocortisone | Stem Cell Technologies | 07904 | |
| C57BL/6 mice | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| Gelatin | Sigma | G-1890 100g | |
| pFUW-tetO | Addgene | Plasmid #20321 | |
| Gata2 | Origene | MR226728 | |
| Gfi1b | Origene | MR204861 | |
| cFos | Addgene | Plasmid #19259 | |
| Etv6 | Origene | MR207053 | |
| psPAX2 | Addgene | Plasmid #12260 | |
| pMD2.G | Addgene | Plasmid #12259 | |
| CaCl2 | Sigma | C5670-100g | |
| FUW-M2rtTA | Addgene | Plasmid #20342 | |
| 35 x 10 mm culture dishes | Thermo Scientific | 171099 |
References
- Zovein, A. C., et al. Fate tracing reveals the endothelial origin of hematopoietic stem cells. Cell Stem Cell. 3 (6), 625-636 (2008).
- Bertrand, J. Y., et al. Haematopoietic stem cells derive directly from aortic endothelium during development. Nature. 464 (7285), 108-111 (2010).
- Papapetrou, E. P., Sadelain, M. Reconstructing blood from induced pluripotent stem cells. F1000 Med Rep. 2, (2010).
- Szabo, E., et al. Direct conversion of human fibroblasts to multilineage blood progenitors. Nature. 468 (7323), 521-526 (2010).
- Mitchell, R., et al. Molecular evidence for OCT4-induced plasticity in adult human fibroblasts required for direct cell fate conversion to lineage specific progenitors. Stem Cells. 32 (8), 2178-2187 (2014).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Qiu, J., Papatsenko, D., Niu, X., Schaniel, C., Moore, K. Divisional history and hematopoietic stem cell function during homeostasis. Stem Cell Reports. 2 (4), 473-490 (2014).
- Riddell, J., et al. Reprogramming committed murine blood cells to induced hematopoietic stem cells with defined factors. Cell. 157 (3), 549-564 (2014).
- Sandler, V. M., et al. Reprogramming human endothelial cells to haematopoietic cells requires vascular induction. Nature. 511 (7509), 312-318 (2014).
- Daniel, M. G., Pereira, C. F., Lemischka, I. R., Moore, K. A. Making a Hematopoietic Stem Cell. Trends Cell Biol. , (2015).
- Pereira, C. F., et al. Induction of a hemogenic program in mouse fibroblasts. Cell Stem Cell. 13 (2), 205-218 (2013).
- Mader, S. L., Libal, N. L., Pritchett-Corning, K., Yang, R., Murphy, S. J. Refining timed pregnancies in two strains of genetically engineered mice. Lab Anim (NY. 38 (9), 305-310 (2009).
- Jain, K., Verma, P. J., Liu, J. Isolation and handling of mouse embryonic fibroblasts). Methods Mol Biol. 1194, 247-252 (2014).
- Bryja, V., Bonilla, S., Arenas, E. Derivation of mouse embryonic stem cells. Nat Protoc. 1 (4), 2082-2087 (2006).
- Carey, B. W., et al. Reprogramming of murine and human somatic cells using a single polycistronic vector. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (1), 157-162 (2009).
- Hockemeyer, D., et al. A drug-inducible system for direct reprogramming of human somatic cells to pluripotency. Cell Stem Cell. 3 (3), 346-353 (2008).
- Taoudi, S., et al. Extensive hematopoietic stem cell generation in the AGM region via maturation of VE-cadherin+CD45+ pre-definitive HSCs. Cell Stem Cell. 3 (1), 99-108 (2008).
- Gekas, C., K, E. R., H, K. A. M. Isolation and analysis of hematopoietic stem cells from the placenta. J Vis Exp. (16), (2008).
- Lewis, I. D., et al. Umbilical cord blood cells capable of engrafting in primary, secondary, and tertiary xenogeneic hosts are preserved after ex vivo culture in a noncontact system. Blood. 97 (11), 3441-3449 (2001).
- Sheridan, J. M., Taoudi, S., Medvinsky, A., Blackburn, C. C. A novel method for the generation of reaggregated organotypic cultures that permits juxtaposition of defined cell populations. Genesis. 47 (5), 346-351 (2009).
- Koh, C. M. Preparation of cells for microscopy using cytospin. Methods Enzymol. 533, 235-240 (2013).
- Orkin, S. H., Zon, L. I. Hematopoiesis: an evolving paradigm for stem cell biology. Cell. 132 (4), 631-644 (2008).
- Martinez-Agosto, J. A., Mikkola, H. K., Hartenstein, V., Banerjee, U. The hematopoietic stem cell and its niche: a comparative view. Genes Dev. 21 (23), 3044-3060 (2007).
- Butler, J. M., et al. Development of a vascular niche platform for expansion of repopulating human cord blood stem and progenitor cells. Blood. 120 (6), 1344-1347 (2012).
- Gori, J. L., et al. Vascular niche promotes hematopoietic multipotent progenitor formation from pluripotent stem cells. J Clin Invest. 125 (3), 1243-1254 (2015).
- Bar-Nur, O., et al. Lineage conversion induced by pluripotency factors involves transient passage through an iPSC stage. Nat Biotechnol. 33 (7), 761-768 (2015).
- Maza, I., et al. Transient acquisition of pluripotency during somatic cell transdifferentiation with iPSC reprogramming factors. Nat Biotechnol. 33 (7), 769-774 (2015).
- Kim, K., et al. Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells. Nature. 467 (7313), 285-290 (2010).
- Vaskova, E. A., Stekleneva, A. E., Medvedev, S. P., Zakian, S. M. “Epigenetic memory: phenomenon in induced pluripotent stem cells. Acta Naturae. 5 (4), 15-21 (2013).
- Elcheva, I., et al. Direct induction of haematoendothelial programs in human pluripotent stem cells by transcriptional regulators. Nat Commun. 5, 4372 (2014).
- Vereide, D. T., et al. An expandable, inducible hemangioblast state regulated by fibroblast growth factor. Stem Cell Reports. 3 (6), 1043-1057 (2014).
- Batta, K., Florkowska, M., Kouskoff, V., Lacaud, G. Direct reprogramming of murine fibroblasts to hematopoietic progenitor cells. Cell Rep. 9 (5), 1871-1884 (2014).
