Riprogrammazione fibroblasti embrionali di topo con fattori di trascrizione per indurre un programma Hemogenic
Summary
The protocol described here details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts via overexpression of a minimal set of transcription factors. This technology may be translated to the human system to provide platforms for future study of hematopoiesis, hematologic disease, and hematopoietic stem cell transplant.
Abstract
This protocol details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) via overexpression of transcription factors (TFs). We first designed a reporter screen using MEFs from human CD34-tTA/TetO-H2BGFP (34/H2BGFP) double transgenic mice. CD34+ cells from these mice label H2B histones with GFP, and cease labeling upon addition of doxycycline (DOX). MEFS were transduced with candidate TFs and then observed for the emergence of GFP+ cells that would indicate the acquisition of a hematopoietic or endothelial cell fate. Starting with 18 candidate TFs, and through a process of combinatorial elimination, we obtained a minimal set of factors that would induce the highest percentage of GFP+ cells. We found that Gata2, Gfi1b, and cFos were necessary and the addition of Etv6 provided the optimal induction. A series of gene expression analyses done at different time points during the reprogramming process revealed that these cells appeared to go through a precursor cell that underwent an endothelial to hematopoietic transition (EHT). As such, this reprogramming process mimics developmental hematopoiesis “in a dish,” allowing study of hematopoiesis in vitro and a platform to identify the mechanisms that underlie this specification. This methodology also provides a framework for translation of this work to the human system in the hopes of generating an alternative source of patient-specific hematopoietic stem cells (HSCs) for a number of applications in the treatment and study of hematologic diseases.
Introduction
Emopoiesi è un processo di sviluppo complesso in cui le cellule staminali ematopoietiche (CSE) germogliano fuori endotelio hemogenic presente in una varietà di siti emopoietiche embrionali, come l'aorta-gonadi-Mesonefro e la placenta 1,2. L'incapacità di coltura in vitro CSE impedisce approfondita analisi di questo processo così come l'applicazione clinica di questi studi. Per aggirare questa limitazione, studi precedenti hanno tentato di derivare cellule staminali emopoietiche de novo sia attraverso la differenziazione delle cellule staminali pluripotenti (PSC) 3, o la plasticità indotta nelle cellule somatiche e la differenziazione diretto utilizzo di supporti riprogrammazione 4,5. Questi studi, tuttavia, non generano le cellule engraftable clinicamente sicuri o consentono lo studio di emopoiesi sviluppo definitivo "in un piatto."
Le cellule staminali pluripotenti Il lavoro romanzo stabilito da Yamanaka e colleghi di generare indotto (iPSCs) da fibroblasti somatica provides un quadro di fattore di trascrizione (TF) strategie basate iperespressione nella cella riprogrammazione destino 6,7. Questo lavoro ha spinto i ricercatori in diversi settori per generare tipi di cellule di scelta tramite TF riprogrammazione delle cellule somatiche facilmente ottenibili. L'obiettivo della strategia di riprogrammazione qui descritto è quello di indurre un processo hemogenic da cellule somatiche di topo usando un approccio riprogrammazione TF base con l'obiettivo di tradurre questi risultati per il sistema umano di riprogrammare fibroblasti paziente-specifici al fine di studiare ematopoiesi umana in vitro e generare prodotti sanguigni paziente-specifici per la modellazione della malattia, test anti-droga, e trapianto di cellule staminali.
Il primo passo per assicurare una corretta riprogrammazione in questo sistema il mouse è stato quello di sviluppare una linea giornalista che è servito come un read-out per l'espressione di CD34, un marker conosciuto in cellule progenitrici endoteliali e cellule staminali emopoietiche. Per fare questo, le linee di topo transgenico huCD34-AS e teto-H2BGFP sono stati usati per generate topo transgenico fibroblasti embrionali doppie (MEF), ora indicati 34 / H2BGFP, che fluorescenza verde dopo l'attivazione del promotore CD34 8. Questo ha permesso lo screening di una varietà di TF notoriamente richiesto in diversi punti durante specifica ematopoietico e sviluppo. Cominciando con 18 TF in PMX vettori retrovial (determinati attraverso la letteratura estrazione e profilatura di etichetta GFP trattenere HSC dalla descritto in precedenza 34 topi / H2BGFP), 34 / H2BGFP MEFs state trasdotte con tutti i fattori e coltivati su AFT024 HSC-portante cellule stromali. Dopo il riconoscimento di 34 / H2BGFP attivazione, TF sono stati successivamente rimossi dal cocktail riprogrammazione fino a quando è stato identificato il set ottimale di TF per l'attivazione giornalista. Dopo questa schermata iniziale, i fattori sono stati trasferiti in un sistema di inducibile vettore DOX pFUW per consentire l'espressione controllabile dei TF. Dal momento che questi due sistemi controllabili DOX sono incompatibili (le celle 34 / H2BGFP e vettori inducibili pFUW), MEF dasono stati necessari wild-type C57BL / 6 topi. E 'stato anche necessario fornire un microambiente appropriato per consentire hemogenesis di procedere e creare progenitori clonogeniche multilineage.
Gli studi attuali che tentano di riprogrammare le cellule somatiche in cellule staminali e progenitrici ematopoietiche (HSPCs) hanno incontrato vari livelli di successo 9-11. Ad oggi, la generazione di entrambi i mouse e HSPCs trapiantabili umani con a lungo termine e di auto-rinnovamento capacità ripopolamento non è stato raggiunto utilizzando lo stesso set di TF. In questo protocollo, forniamo una descrizione dettagliata della strategia precedentemente stabilito per indurre riproducibile hemogenesis in MEF. Abbiamo dimostrato che l'introduzione di un insieme minimo di TF (GATA2, Gfi1b, i CFO, e Etv6) è in grado di istigare un programma di sviluppo complesso in vitro che fornisce una piattaforma con la quale emopoiesi sviluppo e applicazione clinica di riprogrammazione ematopoietiche possono essere studiate ulteriormente 12.
Protocol
Representative Results
Discussion
Generazione HSPCs de novo da cellule somatiche facilmente raggiungibili offre un metodo unico per studiare ematopoiesi in vitro, e la possibilità di potenzialmente applicare questa tecnologia al sistema umano. Questa traduzione genererebbe un nuovo strumento per studiare la malattia ematologica umana in un piatto, oltre a fornire le piattaforme di prova della droga e gene targeting opportunità per il trattamento di numerose malattie con terapie nuove o trapianti di CSE. Nel campo, recenti studi hanno…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by an NHLBI grant to K.M. and I.R.L. (1RO1HL119404). Carlos-Filipe Pereira was the recipient of a Revson Senior Biomedical Fellowship. We gratefully acknowledge the Mount Sinai hESC/iPSC Shared Resource Facility and S. D’Souza for assistance with materials and protocols. We also thank the Mount Sinai Flow Cytometry, Genomics, and Mouse facilities.
Materials
| DMEM | Invitrogen | 11965-092 | |
| 0.45uM filters | Corning | 430625 | |
| Amicon Ultra centrifugal filters | Millipore | UFC900324 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030-081 | |
| FBS | Gemini's Benchmark | 100-106 | |
| PBS | Life Technologies | 14190-144 | |
| 18G needles | BD | 305195 | |
| 20G needles | BD | 305175 | |
| 25G needles | BD | 305125 | |
| Collagenase Type I | Sigma | C0130-100MG | |
| TrypLE Express | Invitrogen | 12605-010 | |
| Myelocult media | Stem Cell Technologies | M5300 | |
| SCF | R & D Systems | 455-MC | |
| Flt3L | R & D Systems | 427-FL | |
| IL-3 | R & D Systems | 403-ML | |
| IL-6 | R & D Systems | 406-ML | |
| TPO | R & D Systems | 488-TO | |
| Doxycycline | Sigma | D9891-1G | |
| Polybrene (hexadimethrine bromide) | Sigma | AL-118 | |
| Durapore 0.65uM membrane filters | Millipore | DVPP14250 | |
| Methylcellulose media | Stem Cell Technologies | Methocult M3434 | |
| Hydrocortisone | Stem Cell Technologies | 07904 | |
| C57BL/6 mice | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| Gelatin | Sigma | G-1890 100g | |
| pFUW-tetO | Addgene | Plasmid #20321 | |
| Gata2 | Origene | MR226728 | |
| Gfi1b | Origene | MR204861 | |
| cFos | Addgene | Plasmid #19259 | |
| Etv6 | Origene | MR207053 | |
| psPAX2 | Addgene | Plasmid #12260 | |
| pMD2.G | Addgene | Plasmid #12259 | |
| CaCl2 | Sigma | C5670-100g | |
| FUW-M2rtTA | Addgene | Plasmid #20342 | |
| 35 x 10 mm culture dishes | Thermo Scientific | 171099 |
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