Перепрограммирование эмбриональных фибробластов мыши с транскрипционных факторов для индуцирования кроветворения программы

Гемопоэз представляет собой сложный процесс развития , при котором гемопоэтические стволовые клетки (ГСК) бутона от гемогенного эндотелий присутствовать в различных эмбриональных сайтах гемопоэтических такие как аорта-гонад-мезонефрос и плацента ^1,2. Неспособность культуры ГСК в пробирке предотвращает глубокий анализ этого процесса, а также клиническое применение этих исследований. Чтобы обойти это ограничение, предыдущие исследования попытались вывести ГСК заново либо с помощью дифференциации плюрипотентных стволовых клеток (ЭСК) ^3, или индуцированной пластичности в соматических клетках и направленной дифференцировки с помощью перепрограммирования СМИ ^4,5. Эти исследования, однако, не приводят к клинически безопасных engraftable клеток или позволяют изучение окончательного кроветворения развития "в чашке".

Роман работа устанавливается Яманака и его коллеги, чтобы генерировать индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК) из соматической фибробласты рrovides рамки для фактора транскрипции (TF) стратегий избыточной экспрессии на основе клеток в судьбе перепрограммирования ^6,7. Эта работа побудила исследователей в различных областях, чтобы генерировать типы клеток выбора через TF перепрограммирования легкодоступных соматических клеток. Цель стратегии перепрограммирования , описанного здесь , чтобы вызвать гемогенного процесс от мыши соматических клеток с использованием TF на основе перепрограммирования подхода с целью воплощения этих результатов в человеческой системе перепрограммировать фибробласты конкретного пациента для того , чтобы изучить человека кроветворение в пробирке и генерировать пациента конкретных продуктов крови для моделирования заболевания, тестирования на наркотики и трансплантации стволовых клеток.

Первым шагом для обеспечения надлежащего перепрограммирование в этой системе мыши было разработать линию репортер, который служил в качестве чтения-аута для экспрессии CD34, известным маркером в эндотелиальных клетках-предшественниках и ГСК. Для этого, трансгенные линии мыши huCD34-TTA и Teto-H2BGFP были использованы для гenerate двойной трансгенной мыши эмбриональные фибробласты (МЭФ), теперь обозначается 34 / H2BGFP, что флуоресцировать зеленым при активации промотора CD34 ^8. Это позволило скрининг различных ТФ, как известно, требуется в различных точках во время кроветворной спецификации и развития. Начиная с 18-ТФ в PMX retrovial векторов (определяется путем добычи и профилирования GFP этикетки удерживающих ГСК из ранее литературы описаны 34 мышей / H2BGFP), 34 / H2BGFP MEFs были трансдуцированных со всеми факторами и культивируют на AFT024 HSC поддерживающих стромальных клеток. После обнаружения 34 активации / H2BGFP, ТФ были впоследствии удалены из перепрограммирования коктейля, пока не был идентифицирован оптимальный набор ТФ для активации репортера. После этого начального экрана, факторы, были переведены в DOX индуцибельной векторной системы pFUW, чтобы позволить управляемое экспрессию ТФ. Так как эти две управляемые системы DOX несовместимы (34 / H2BGFP клетки и индуцируемые векторы pFUW), MEFs изтребовалось 6 мышей дикого типа C57BL /. Кроме того, необходимо обеспечить соответствующую микросреду, чтобы позволить гемопоэз, чтобы продолжить и создать мультилинейной клоногенные клетки-предшественники.

Современные исследования пытаются перепрограммировать соматические клетки в гемопоэтических стволовых клеток и клеток – предшественников (HSPCs) встречались различные уровни успеха ^9-11. На сегодняшний день, поколение как мыши и перевиваемых HSPCs человека с длительным сроком и самообновлению заселив способность не была достигнута с использованием того же набора ТФ. В этом протоколе, мы приводим подробное описание ранее установленной стратегии воспроизводимо индуцируют гемопоэз в MEFs. Показано , что введение минимального набора ТФ (Gata2, Gfi1b, CFO , и Etv6) способен подстрекательстве комплексную программу развития в пробирке , которая обеспечивает платформу , с помощью которого кроветворения развития и клиническое применение гемопоэтических перепрограммирования может быть дополнительно изучена ^12.