Reprogramação do rato embrionárias fibroblastos com Fatores de transcrição para induzir um Programa hegemônicos
Summary
The protocol described here details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts via overexpression of a minimal set of transcription factors. This technology may be translated to the human system to provide platforms for future study of hematopoiesis, hematologic disease, and hematopoietic stem cell transplant.
Abstract
This protocol details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) via overexpression of transcription factors (TFs). We first designed a reporter screen using MEFs from human CD34-tTA/TetO-H2BGFP (34/H2BGFP) double transgenic mice. CD34+ cells from these mice label H2B histones with GFP, and cease labeling upon addition of doxycycline (DOX). MEFS were transduced with candidate TFs and then observed for the emergence of GFP+ cells that would indicate the acquisition of a hematopoietic or endothelial cell fate. Starting with 18 candidate TFs, and through a process of combinatorial elimination, we obtained a minimal set of factors that would induce the highest percentage of GFP+ cells. We found that Gata2, Gfi1b, and cFos were necessary and the addition of Etv6 provided the optimal induction. A series of gene expression analyses done at different time points during the reprogramming process revealed that these cells appeared to go through a precursor cell that underwent an endothelial to hematopoietic transition (EHT). As such, this reprogramming process mimics developmental hematopoiesis “in a dish,” allowing study of hematopoiesis in vitro and a platform to identify the mechanisms that underlie this specification. This methodology also provides a framework for translation of this work to the human system in the hopes of generating an alternative source of patient-specific hematopoietic stem cells (HSCs) for a number of applications in the treatment and study of hematologic diseases.
Introduction
A hematopoiese é um processo complexo de desenvolvimento em que as células estaminais hematopoiéticas (HSCs) brotam endotélio hegemônicos presente numa variedade de sítios hematopoiéticas embrionárias, tais como a aorta-gônadas-Mesonefros e da placenta 1,2. A incapacidade de cultura hsc in vitro evita a análise em profundidade deste processo, bem como a aplicação clínica destes estudos. Para ultrapassar esta limitação, estudos anteriores têm tentado derivar HSCs de novo, quer por meio de diferenciação das células estaminais pluripotentes (PSCs) 3, ou plasticidade induzida em células somáticas e diferenciação dirigida utilizando meios de reprogramação 4,5. Estes estudos, no entanto, não geram células engraftable clinicamente seguras ou permitir o estudo da hematopoiese desenvolvimento definitivo "em um prato."
O romance de trabalho estabelecido por Yamanaka e seus colegas para gerar células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) a partir de fibroblastos somática pferece um quadro de fator de transcrição (TF) estratégias superexpressão baseados em célula destino reprogramação 6,7. Este trabalho levou os pesquisadores em vários campos para gerar tipos de células de escolha através de TF reprogramação de células somáticas de fácil obtenção. O objetivo da estratégia de reprogramação descrito aqui é para induzir um processo hegemônicos a partir de células somáticas de rato usando uma abordagem de reprogramação TF base com o objetivo de traduzir esses achados para o sistema humano para reprogramar fibroblastos específicos do paciente, a fim de estudar hematopoiese humana in vitro e gerar produtos derivados de sangue específicos do paciente para a modelagem de doenças, testes de drogas e transplante de células estaminais.
O primeiro passo para assegurar reprogramação adequada neste sistema de ratinho foi desenvolver uma linha repórter que serviu como uma leitura para a expressão de CD34, um marcador conhecido nas células progenitoras endoteliais e HSCs. Para fazer isso, as linhagens de camundongos transgênicos huCD34-tTA e TetO-H2BGFP foram usadas para generate rato transgénico fibroblastos embrionários duplos (MEFs), agora denotado 34 / H2BGFP, que apresentam fluorescência verde após a ativação do promotor CD34 8. Isto permitiu o rastreio de uma variedade de TFs conhecidos que sejam necessários em diferentes pontos durante a especificação e desenvolvimento hematopoiético. Começando com 18 TFs em PMX vetores retrovial (determinado através da mineração literatura e profiling de etiqueta GFP manter HSCs do descrito anteriormente 34 / H2BGFP ratos), 34 / H2BGFP MEFs foram transduzidas com todos os factores e cultivadas em AFT024 HSC-apoiando células estromais. Após a detecção de 34 / H2BGFP ativação, TFs foram posteriormente removido do cocktail reprogramação até o melhor conjunto de TFs para ativação repórter foi identificado. Após esta primeira tela, os factores foram transferidos para um sistema de vector indutível pFUW DOX para permitir a expressão controlável de TFS. Uma vez que estes dois sistemas controláveis DOX são incompatíveis (34 células / H2BGFP e os vectores indutíveis pFUW), MEFs deDe tipo selvagem C57BL / 6 murganhos foram necessários. Foi também necessário para proporcionar um microambiente adequado permitir hemogenesis para prosseguir e criar progenitores clonog�icas multilinhagem.
Os estudos atuais que tentam reprogramar células somáticas em células-tronco e progenitoras hematopoiéticas (hspCs) reuniram-se níveis variados de sucesso 9-11. Até à data, a geração de ambos rato transplantáveis e hspCs humanos com a longo prazo e capacidade de repovoamento auto-renovação não foi alcançado utilizando o mesmo conjunto de FT. Neste protocolo, nós fornecemos uma descrição detalhada da estratégia previamente estabelecido para induzir reproducibly hemogenesis em MEFs. Nós demonstramos que a introdução de um conjunto mínimo de TFs (GATA2, Gfi1b, CFOs e ETV6) é capaz de instigar um programa complexo de desenvolvimento in vitro que fornece uma plataforma através da qual hematopoiese desenvolvimento e aplicação clínica de reprogramação hematopoiéticas podem ser mais bem estudadas 12.
Protocol
Representative Results
Discussion
Gerando hspCs de novo a partir de células somáticas facilmente atingíveis oferece um método único para estudar a hematopoiese in vitro, e a oportunidade para potencialmente aplicar esta tecnologia para o sistema humano. Esta tradução iria gerar uma nova ferramenta para o estudo da doença hematológica humano em um prato, bem como fornecer plataformas de teste de drogas e direccionamento de genes oportunidades para o tratamento de numerosas desordens com novos agentes terapêuticos ou d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by an NHLBI grant to K.M. and I.R.L. (1RO1HL119404). Carlos-Filipe Pereira was the recipient of a Revson Senior Biomedical Fellowship. We gratefully acknowledge the Mount Sinai hESC/iPSC Shared Resource Facility and S. D’Souza for assistance with materials and protocols. We also thank the Mount Sinai Flow Cytometry, Genomics, and Mouse facilities.
Materials
| DMEM | Invitrogen | 11965-092 | |
| 0.45uM filters | Corning | 430625 | |
| Amicon Ultra centrifugal filters | Millipore | UFC900324 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030-081 | |
| FBS | Gemini's Benchmark | 100-106 | |
| PBS | Life Technologies | 14190-144 | |
| 18G needles | BD | 305195 | |
| 20G needles | BD | 305175 | |
| 25G needles | BD | 305125 | |
| Collagenase Type I | Sigma | C0130-100MG | |
| TrypLE Express | Invitrogen | 12605-010 | |
| Myelocult media | Stem Cell Technologies | M5300 | |
| SCF | R & D Systems | 455-MC | |
| Flt3L | R & D Systems | 427-FL | |
| IL-3 | R & D Systems | 403-ML | |
| IL-6 | R & D Systems | 406-ML | |
| TPO | R & D Systems | 488-TO | |
| Doxycycline | Sigma | D9891-1G | |
| Polybrene (hexadimethrine bromide) | Sigma | AL-118 | |
| Durapore 0.65uM membrane filters | Millipore | DVPP14250 | |
| Methylcellulose media | Stem Cell Technologies | Methocult M3434 | |
| Hydrocortisone | Stem Cell Technologies | 07904 | |
| C57BL/6 mice | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| Gelatin | Sigma | G-1890 100g | |
| pFUW-tetO | Addgene | Plasmid #20321 | |
| Gata2 | Origene | MR226728 | |
| Gfi1b | Origene | MR204861 | |
| cFos | Addgene | Plasmid #19259 | |
| Etv6 | Origene | MR207053 | |
| psPAX2 | Addgene | Plasmid #12260 | |
| pMD2.G | Addgene | Plasmid #12259 | |
| CaCl2 | Sigma | C5670-100g | |
| FUW-M2rtTA | Addgene | Plasmid #20342 | |
| 35 x 10 mm culture dishes | Thermo Scientific | 171099 |
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