영상은 단일 셀 해상도에서 배아 및 출생 후의 마음을 해제
Summary
We describe a protocol to volumetrically image fluorescent protein labeled cells deep inside intact embryonic and postnatal hearts. Utilizing tissue-clearing methods in combination with whole mount staining, single fluorescent protein-labeled cells inside an embryonic or postnatal heart can be imaged clearly and accurately.
Abstract
전체 심장 수준에서 단일 클론 추적 및 분석 심장 개발하는 동안 심장 전구 세포의 행동과 분화를 결정하고, 정상 및 비정상 심장 형태 형성의 세포 및 분자 기초 연구를 허용 할 수 있습니다. 회고전 단일 클론 분석 최근 새로운 기술은 단일 세포 해상도에서 심장 형태 형성의 연구가 가능합니다. 그러나 조직의 불투명도 및 이미징 깊이와 마음의 빛 산란은 단일 셀 해상도을 방해 전체 심장 이미징 증가한다. 이러한 장애, 개발해야 조명 및 검출 모두 매우 투명 마음을 렌더링 할 수있는 전체 배아 청산 시스템을 극복하기 위해. 다행히 지난 몇 년 동안, 같은 CLARITY으로 전체 유기체의 청산 시스템, 무서 제작, SeeDB, ClearT, 3DISCO, CUBIC, DBE, BABB 및 PACT위한 많은 방법들이보고되었다. 이 연구소는 카드의 세포 및 분자 메커니즘에 관심IAC의 형태 형성. 최근에, 우리는 ROSA26-Cre 호텔 ERT2를 통해 추적 단일 세포 계보를 설립, 드문 드문 라벨 세포에 ROSA26 – 색종이 시스템을 심장 개발하는 동안. 우리는 마음 안에 이미지 단일 클론에 전체 마운트 얼룩과 함께 배아을 취소 무서 제작 및 CUBIC (일반, 탁 트인 뇌 영상 칵테일 및 전산 분석) 등 여러 전체 배아 삭제 방법을 적용. 심장은 성공적 단세포 해상도로 촬상 하였다. 우리는 CUBIC 출생 후의 마음을 지울 수 있습니다 동안 무서 르가, 배아 심장을 취소 할 수 있지만, 효과적으로 출생 마음을 지울 수 없습니다 것을 발견하지만, 손상 조직을 용해하여 배아 마음입니다. 여기에 설명 된 방법은 차례로, 선천성 심장병의 세포 및 분자 기초를 밝힐 수 심장 형태 형성 중에 단일 클론 해상도 유전자 기능 연구를 허용한다.
Introduction
심장 형태 형성은 심장의 별개 섹터로 심장 전구 세포의 네 가지 유형의 시공간 구성을 필요로하는 일련의 이벤트이며, 또한 기능성 심장 1,2-을 형성하는이 과정을 조율하기 위해 여러 유전자 조절 네트워크를 필요로한다. 심장 사양, 차별화, 패턴, 챔버의 성숙은 심장 성 전사 인자 (3)에 의해 조절된다. 유전자 돌연변이 또는 심장 전구 세포에서 이러한 요인의 전사 후 수차는 배아 치사 또는 선천성 심장 결함 (CHD) 4 중 발생할 수 있습니다. 심장 형태 형성의 연구는 심장 형태 형성에 대한 이해를 촉진 심장 개발하는 동안 추적을 세 가지 차원 (3D) 고유의 세부 구조 및 단일 레이블 심장 전구 세포 계보의 이해를 필요로한다. 고해상도 부 기초 단층 다수의 방법 일 개발되어왔다이미지 기관 구조 5,6에 수십 년 과거 전자; 그러나, 이러한 방법은 고가의 특화된 장비 광범위한 노동력을 필요로하고, 최종 부피 화상 7,8 재구성 단일 셀 해상도의 상세한 구성 조직이 부족하다.
단일 세포 수준에서 3D 용적 촬상 생체 7 전구 세포 분화 및 세포의 거동을 연구하기위한 수단을 제공한다. 그러나 조직 광 산란 깊은 그대로 마음 안에 3D로 세포 구조를 이미징에 주요 장애물이 남아있다. 조직 투명성 8 증가 가능성 접근법 지질 광산란의 주요 원인, 지질 및 / 또는 지질 및 그 주변 영역 사이의 굴절률 차의 조정 제거되어있다. 지난 몇 년 동안, 조직 청산 방법의 수는 조직의 불투명도 및 빛의 산란을 줄일 수있는 개발되었다 BABB (벤질 알코올, 벤질 benzoat 등전자 혼합물)과 DBE (테트라 히드로 푸란 dibenzylether); 그러나이 방법에서, 형광 소광 문제 8-10 남아있다. 용매, 예를 SeeDB (과당 / 티오 글리세롤) 및 3DISCO (디클로로 메탄 / dibenzylether)와 같은 친수성 방법을 기반으로 형광 신호를 보존하지만, 7,8,11 투명 전체 기관을 렌더링하지 않습니다. 이에 비해 선명도 조직 소거 방법은 장기 투명 렌더링, 또한 하이드로 겔 7,13 매립 필요 PACT (수동 명확성 기법)처럼 그 지질 8,12을 제거 전문 전기 영동 장치를 필요로한다. 사용 가능한 모든 조직 삭제 방법에 대한 자세한 내용 등 리처드슨과 Lichtman, 표 1을 참조하십시오. 7.
2011 년, 하마는 등. serendipitously 친수성 혼합물 '무서 르를'발견 (우레아, 글리세롤 및 트리톤 X-100 혼합물) 마우스 뇌와 배아 transpar를 렌더링하는천만에 완전히 표시 클론 (14)로부터 형광 신호를 보존하면서. 이는 세포 내 해상도 밀리미터 및 신경 집단과 돌기의 대규모 개조의 깊이에서 뇌 손상의 이미징을 허용한다. 사키 등. 또한 아미노 알코올을 첨가하여 제작 무서에게 개선 및 인지질 용해를 증가 'CUBIC'(일반, 탁 트인 뇌 영상 칵테일 및 전산 분석) 조직 청소 방법, 감소 청소 시간을 개발하고, 여러 가지 빛깔의 형광 이미징 8 허용했다. 본 연구에서는 cardiogenesis 동안 심장 내부의 무서 제작의 장점과 CUBIC 조직 청소 기술과 고해상도 3D 광학 절편, 각각의 클론을 복용 Rosa26Cre ERT2 15 R26R – 색종이 (16), αMHC-Cre 호텔 17, cTnT를-Cre 호텔을 사용하여 추적했다 18 일 </strong> Nfatc1-Cre 호텔 (19), 및 Rosa26-mTmG (mTmG) 20 마우스 라인. 전체 마운트 염색 (WMS) 방법의 조합은 이전에 (21, 22)를 더 표시 클론의 다른 단백질의 염색과 3 차원 체적 맥락에서 자신의 행동의 연구에 허용 조직 청산 방법과를 개발했다. 조직 및 정화 WMS의 조합은 심장 개발시 다른 유전자와 단백질의 역할을 이해하고, 선천성 심장 결함의 원인을 허용한다. 이 프로토콜 개발시 다른 전구 세포의 분화, 세포의 행동 및 장기 형태 발생 이벤트 연구에 적용될 수있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
배아 분리는 매우 중요한 단계입니다. E9.5의 배아 때문에 각별한주의가 분리 동안 배아 / 심장 구조 손상되지 않도록주의해야한다, 크기가 매우 깨지기 쉬운 작은 있습니다. 전체 배아를 이미징 할 때 배아 / 마음을 포위 비 배아 여분의 층은 신중하게, 특히 제거해야합니다. 이 배아 조직 내부에 깊은 항체 및 청산 혼합물의 침투를 허용하고, 또한 이미징 때 배경 신호를 제거하는 데 도움이됩니다…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank M.W. laboratory members for scientific discussion. This work is supported by AHA [13SDG16920099] to M.W., and by National Heart, Lung, and Blood Institute grants [R01HL121700] to M.W. Images were captured in the Imaging Core Facility at the Albany Medical College.
Materials
| 2,2′,2′’-nitrilotriethanol | Sigma Aldrich | 90279 | |
| 4% Paraformaldehyde in PBS | Affymetrix | 19943 | |
| BSA | Fischer Scientific | BP16000 | |
| N,N,N’,N’-tetrakis(2-hydroxypropyl) ethylenediamine | Sigma Aldrich | 122262 | |
| Phosphate Buffer Saline | Sigma Aldrich | P5368-10PAK | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Urea | Sigma Aldrich | U-1250 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | 84097 | |
| Glycerol | Sigma Aldrich | G8773 | |
| Tamoxifen | Sigma Aldrich | T5648 | |
| Sunflower seed oil | Sigma Aldrich | S5007 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P1379 | |
| PECAM (CD31) | BD Pharmingen | 550274 | |
| Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A-21247 | |
| DAPI nuclear stain | Sigma Aldrich | D9542 | |
| 37oC Incubator | Thermoscientific Fischer | Heratherm, Compact Microbiological Incubators | |
| 48 well plates | Cell Treat | 229148 | |
| Analytical Balance | Metler Toledo | PB153-S/FACT | |
| Confocal microscope | Zeiss | Zeiss 510 confocal microscope | |
| Disecting Microscope | Unitron | Z850 | |
| Fluorescent microscope | Zeiss | Observer. Z1 | |
| Germinator 500 Glass Bead Sterilizer | CellPoint Scientific | GER-5287-120V | |
| Light Source | SCHOTT | ACE I | |
| Pair of Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Petri dish 60x15mm | TPP Techno Plastic Products AG | 93060 | |
| Rocker II Platform Rocker | Boekel Scientific | 260350 | |
| Scintillating tubes | Fischer Scientific | 03-337-26 | |
| Transfer pipette | Samco Scientific | 202 | |
| Tweezers | Fine Science Tools | 11251-20 |
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