Imagiologia Cleared embrionário e pós-natal Corações na resolução de célula única

Morfogénese cardíaca é um evento sequencial requer que a organização espaço-temporal de quatro tipos diferentes de células progenitoras cardíacas em sectores distintos do coração, e também requer múltiplas redes reguladoras genéticos para orquestrar este processo de modo a formar a ^1,2 coração funcional. Especificação, diferenciação, padronização, e maturação das câmaras cardíacas são regulados por fatores de transcrição cardiogênicos ^3. Mutação genética ou aberração pós-transcricional desses fatores em células progenitoras cardíacas pode resultar em qualquer letalidade embrionária ou cardiopatias congênitas (CC) ^4. O estudo da morfogênese cardíaca requer uma compreensão de detalhes inerentes estruturais em três dimensões (3D) e linhagem de células progenitoras cardíacas simples marcado com traçado durante o desenvolvimento cardíaco irá promover o entendimento da morfogênese cardíaca. Um número de métodos de tomografia secção base de alta resolução foram desenvolvidos no the passado poucas décadas a imagem Estrutura de órgãos ^5,6; No entanto, estes métodos requerem, instrumentos especializados caros, mão de obra extensa, e carecem de organização estrutural detalhada em resolução de uma única célula na volumétrica final, reconstruído imagem ^7,8.

Imagiologia volumétrica 3D ao nível da célula individual fornece um meio para estudar diferenciação de células progenitoras e o comportamento celular in vivo ^7. No entanto, espalhamento de luz tecido permanece o principal obstáculo para imagiologia células e estruturas em 3D profundamente dentro do coração intacto. Lipídios são uma importante fonte de dispersão de luz, ea remoção de lípidos e / ou ajuste da diferença do índice de refração entre lipídios e seus arredores são abordagens potenciais para aumentar a transparência do tecido ^8. Nos últimos anos, um número de métodos de limpeza de tecido foram desenvolvidos, que reduzir a opacidade do tecido e dispersão de luz, como BABB (álcool de benzilo e benzilo benzoate mistura) e DBE (tetra-hidrofurano e dibenzylether); mas nestes métodos, extinção de fluorescência permanece um problema ^8-10. O solvente baseado métodos hidrofílicos, tais como SeeDB (frutose / tioglicerol) e 3DISCO (diclorometano / dibenzylether), preservar sinais fluorescentes, mas não tornem todo o órgão transparente ^7,8,11. Em comparação, o método tecido desobstrução-Clareza torna o órgão transparente, mas exige um dispositivo de electroforese especializada para remover os lípidos ^8,12, assim como Pact (técnica passiva clareza), que também requer a incorporação de hidrogel ^7,13. Para informações detalhadas sobre todos os métodos de remoção de tecidos disponíveis, consulte a Tabela 1 em Richardson e Lichtman, et al. ^7.

Em 2011, Hama et al. Serendipitously descobriu uma mistura hidrofílica 'Sca le' (uréia, glicerol e Triton mistura X-100), que torna o cérebro do rato e transpar embriãoent completamente, preservando sinais fluorescentes a partir de clones marcados ^14. Isto permite a formação de imagens do cérebro intacto a uma profundidade de vários milímetros e reconstrução em grande escala de populações neuronais e as projecções com uma resolução subcelular. Susaki et ai. melhorada Sca le adicionando aminoálcoois e desenvolveu o (e desobstruídas cocktails claras de imagem cerebral e análise computacional) 'CÚBICAS "método de compensação do tecido, o que aumentou a solubilização fosfolipídios, reduziu o tempo de compensação, e permitiu multicolor fluorescente imaging ^8. No presente estudo, aproveitando a Sca le e técnicas de limpeza cúbica de tecido e alta resolução seccionamento óptico 3D, clones individuais dentro do coração durante cardiogenesis foram rastreados usando Rosa26Cre ^{ERT2 15,} R26R-Confetti ^16, αMHC-Cre ^17, cTnT-Cre ^18, </strong> NFATc1-Cre ^19, e Rosa26-mTmG (mTmG) ²⁰ linhas de rato. A combinação do método de coloração de montagem inteira (WMS) desenvolvido anteriormente ^21,22 com métodos de compensação de tecido mais permitidos para a coloração de outras proteínas em clones marcados e para o estudo do seu comportamento em um contexto volumétrica 3D. A combinação de tecido e de compensação WMS permite uma melhor compreensão dos papéis dos diferentes genes e proteínas durante o desenvolvimento cardíaco, e a etiologia de defeitos cardíacos. Este protocolo pode ser aplicado para estudar diferenciação de células progenitoras outro, o comportamento celular, e morfogénese eventos órgão durante o desenvolvimento.