Imaging Effacé embryonnaire et postnatal coeurs à la résolution unicellulaire
Summary
We describe a protocol to volumetrically image fluorescent protein labeled cells deep inside intact embryonic and postnatal hearts. Utilizing tissue-clearing methods in combination with whole mount staining, single fluorescent protein-labeled cells inside an embryonic or postnatal heart can be imaged clearly and accurately.
Abstract
traçage clonale unique et analyse au niveau entier cardiaque peut déterminer le comportement des cellules progénitrices cardiaques et la différenciation au cours du développement cardiaque, et permettre l'étude de la base cellulaire et moléculaire de la morphogenèse cardiaque normale et anormale. Les technologies récentes émergentes d'analyses clonales simples rétrospectives rendent l'étude de la morphogenèse cardiaque à résolution cellulaire unique possible. Cependant, l'opacité des tissus et diffusion de la lumière du cœur comme la profondeur d'imagerie augmente l'imagerie entier coeur hinder à la résolution d'une seule cellule. Pour surmonter ces obstacles, un système de compensation entier embryon qui peut rendre le cœur très transparent à la fois l'éclairage et de détection doivent être développés. Heureusement, au cours des dernières années, de nombreuses méthodes pour les systèmes de compensation des organismes entiers tels que CLARITY, Sca le, SeeDB, ClearT, 3DISCO, CUBIC, DBE, BABB et PACT ont été rapportés. Ce laboratoire est intéressé par les mécanismes cellulaires et moléculaires de la cartemorphogenèse iac. Récemment, nous avons établi seule lignée cellulaire de traçage via le ROSA26-Cre ERT2; système ROSA26-Confetti pour marquer les cellules à faible densité au cours du développement cardiaque. Nous avons adapté plusieurs méthodes entières d'embryons de compensation , y compris le Sca et CUBES (, dégagée cocktails d'imagerie cérébrale claires et une analyse informatique) pour effacer l'embryon en combinaison avec toute coloration de montage à l' image des clones individuels à l' intérieur du cœur. Le cœur a été imagé avec succès à la résolution d'une seule cellule. Nous avons constaté que Sca le peut effacer le coeur embryonnaire, mais ne peut pas effacer efficacement le cœur postnatale, tandis que CUBIC peut effacer le coeur postnatale, mais endommage le coeur embryonnaire en dissolvant le tissu. Les méthodes décrites ici permettront l'étude de la fonction des gènes à une résolution de clone unique lors de la morphogenèse cardiaque, qui, à son tour, peut révéler la base moléculaire et cellulaire des malformations cardiaques congénitales.
Introduction
Morphogenèse cardiaque est un événement séquentiel qui nécessite l'organisation spatio – temporelle des quatre types de cellules progénitrices cardiaques différentes dans des secteurs distincts du coeur, et requiert également des réseaux de régulation génétiques multiples pour orchestrer ce processus pour former le 1,2 cardiaque fonctionnel. Cardiac spécification, la différenciation, la structuration et la chambre de maturation sont régies par des facteurs de transcription cardiogénique 3. Une mutation génétique ou une aberration post – transcriptionnelle de ces facteurs dans les cellules progénitrices cardiaques pourraient entraîner soit une létalité embryonnaire ou malformations cardiaques congénitales (CHD) 4. L'étude de la morphogenèse cardiaque nécessite une compréhension des détails inhérents structurels en trois dimensions (3D) et seule cardiaque lignée de cellules progénitrices marqué de traçage au cours du développement cardiaque favorisera la compréhension de la morphogenèse cardiaque. Un certain nombre de sections sur la base des méthodes de tomographie à haute résolution ont été développés en ee depuis quelques décennies à la structure 5,6 d'organes d'image; Cependant, ces méthodes nécessitent coûteuses, des instruments spécialisés, une vaste main – d'œuvre, et manquent de l' organisation structurelle détaillée à une résolution de cellule dans l' image 7,8 volumétrique finale reconstruite.
Imagerie volumétrique 3D au niveau de la cellule unique fournit un moyen pour étudier la différenciation des cellules progénitrices et le comportement cellulaire in vivo 7. Cependant, la diffusion de lumière de tissu reste le principal obstacle à l'imagerie des cellules et des structures en 3D en profondeur dans le cœur intact. Les lipides sont une source majeure de diffusion de la lumière, et l'élimination des lipides et / ou le réglage de la différence d'indice de réfraction entre les lipides et les zones environnantes sont les approches possibles pour accroître la transparence des tissus 8. Au cours des dernières années, un certain nombre de méthodes de compensation de tissus ont été développés, qui réduisent l'opacité des tissus et diffusion de la lumière, comme BABB (alcool benzylique et benzyle benzoatemélange e) et DBE (tétrahydrofuranne et dibenzylether); mais dans ces méthodes, la fluorescence reste un problème 8-10. Le solvant basé méthodes hydrophiles, tels que SeeDB (fructose / thioglycérol) et 3DISCO (dichlorométhane / dibenzylether), préserver des signaux fluorescents, mais ne rendent pas tout l' organe transparent 7,8,11. En comparaison, la méthode de dégagement du tissu CLARITY rend l'organe transparent, mais il a besoin d' un dispositif d'électrophorèse spécialisé pour éliminer les lipides 8,12, comme le fait PACT (technique de clarté passive), qui nécessite également un hydrogel enrobage 7,13. Pour des informations détaillées sur toutes les méthodes de tissus de compensation disponibles, reportez – vous au tableau 1 Richardson et Lichtman, et al. 7.
En 2011, Hama et coll. Serendipitously découvert un mélange hydrophile 'Sca le' ( l' urée, le glycérol et le Triton X-100 du mélange) qui rend le cerveau de souris et de l' embryon transpaent tout en préservant totalement des signaux fluorescents provenant des clones étiquetés 14. Ceci permet l'imagerie du cerveau intacte à une profondeur de quelques millimètres et la reconstruction à grande échelle des populations neuronales et les projections à une résolution subcellulaire. Susaki et al. encore amélioré Sca le en ajoutant aminoalcools et développé le 'cubic' (, dégagée cocktails clairs d'imagerie cérébrale et une analyse informatique) méthode de compensation des tissus, qui ont augmenté solubilisation phospholipides, la réduction du temps de compensation, et a permis multicolore fluorescent imagerie 8. Dans la présente étude, en profitant de la Sca le et les techniques de compensation des tissus CUBES et haute résolution tronçonnage optique 3D, des clones individuels à l' intérieur du coeur pendant cardiogenèse ont été retracés en utilisant Rosa26Cre ERT2 15, R26R-Confetti 16, αMHC-Cre 17, cTnT-Cre 18, </strong> NFATc1-Cre 19 et Rosa26-MTMG (MTMG) 20 Les lignées de souris. La combinaison de la méthode toute coloration de montage (WMS) développé précédemment 21,22 avec des méthodes de compensation des tissus plus autorisés pour la coloration d'autres protéines dans les clones étiquetés et pour l'étude de leur comportement dans un contexte volumétrique 3D. La combinaison de la compensation des tissus et WMS permet une meilleure compréhension des rôles des différents gènes et des protéines au cours du développement cardiaque, et l'étiologie des malformations cardiaques congénitales. Ce protocole peut être appliqué à d'autres études de différenciation des cellules progénitrices, le comportement cellulaire, et les événements de morphogenèse d'organes au cours du développement.
Protocol
Representative Results
Discussion
L'isolement de l'embryon est une étape très critique. embryons E9.5 sont très fragiles et de petite taille, de sorte que des précautions supplémentaires doivent être prises pour ne pas endommager les structures embryon / coeur lors de l'isolement. Les couches supplémentaires non embryonnaires enveloppant l'embryon / cardiaque doivent être soigneusement enlevées en particulier lorsque l'imagerie de l'embryon entier. Ceci permet la pénétration du mélange d'anticorps et de compensati…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank M.W. laboratory members for scientific discussion. This work is supported by AHA [13SDG16920099] to M.W., and by National Heart, Lung, and Blood Institute grants [R01HL121700] to M.W. Images were captured in the Imaging Core Facility at the Albany Medical College.
Materials
| 2,2′,2′’-nitrilotriethanol | Sigma Aldrich | 90279 | |
| 4% Paraformaldehyde in PBS | Affymetrix | 19943 | |
| BSA | Fischer Scientific | BP16000 | |
| N,N,N’,N’-tetrakis(2-hydroxypropyl) ethylenediamine | Sigma Aldrich | 122262 | |
| Phosphate Buffer Saline | Sigma Aldrich | P5368-10PAK | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Urea | Sigma Aldrich | U-1250 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | 84097 | |
| Glycerol | Sigma Aldrich | G8773 | |
| Tamoxifen | Sigma Aldrich | T5648 | |
| Sunflower seed oil | Sigma Aldrich | S5007 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P1379 | |
| PECAM (CD31) | BD Pharmingen | 550274 | |
| Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A-21247 | |
| DAPI nuclear stain | Sigma Aldrich | D9542 | |
| 37oC Incubator | Thermoscientific Fischer | Heratherm, Compact Microbiological Incubators | |
| 48 well plates | Cell Treat | 229148 | |
| Analytical Balance | Metler Toledo | PB153-S/FACT | |
| Confocal microscope | Zeiss | Zeiss 510 confocal microscope | |
| Disecting Microscope | Unitron | Z850 | |
| Fluorescent microscope | Zeiss | Observer. Z1 | |
| Germinator 500 Glass Bead Sterilizer | CellPoint Scientific | GER-5287-120V | |
| Light Source | SCHOTT | ACE I | |
| Pair of Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Petri dish 60x15mm | TPP Techno Plastic Products AG | 93060 | |
| Rocker II Platform Rocker | Boekel Scientific | 260350 | |
| Scintillating tubes | Fischer Scientific | 03-337-26 | |
| Transfer pipette | Samco Scientific | 202 | |
| Tweezers | Fine Science Tools | 11251-20 |
References
- Vincent, S. D., Buckingham, M. E. How to make a heart: the origin and regulation of cardiac progenitor cells. Curr Top Dev Biol. 90, 1-41 (2010).
- Olson, E. N. A decade of discoveries in cardiac biology. Nat Med. 10, 467-474 (2004).
- Olson, E. N. Gene regulatory networks in the evolution and development of the heart. Science. 313, 1922-1927 (2006).
- Bruneau, B. G. The developmental genetics of congenital heart disease. Nature. 451, 943-948 (2008).
- Mohun, T. J., Weninger, W. J. Embedding embryos for high-resolution episcopic microscopy (HREM). Cold Spring Harb Protoc. , 678-680 (2012).
- Soufan, A. T., et al. Three-dimensional reconstruction of gene expression patterns during cardiac development. Physiol Genomics. 13, 187-195 (2003).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162, 246-257 (2015).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157, 726-739 (2014).
- Becker, K., Jahrling, N., Saghafi, S., Weiler, R., Dodt, H. U. Chemical clearing and dehydration of GFP expressing mouse brains. PLoS One. 7, e33916 (2012).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nat Protoc. 7, 1983-1995 (2012).
- Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat Neurosci. 16, 1154-1161 (2013).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497, 332-337 (2013).
- Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158, 945-958 (2014).
- Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).
- Badea, T. C., Wang, Y., Nathans, J. A noninvasive genetic/pharmacologic strategy for visualizing cell morphology and clonal relationships in the mouse. J Neurosci. 23, 2314-2322 (2003).
- Livet, J., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450, 56-62 (2007).
- Agah, R., et al. Gene recombination in postmitotic cells. Targeted expression of Cre recombinase provokes cardiac-restricted, site-specific rearrangement in adult ventricular muscle in vivo. J Clin Invest. 100, 169-179 (1997).
- Jiao, K., et al. An essential role of Bmp4 in the atrioventricular septation of the mouse heart. Genes Dev. 17, 2362-2367 (2003).
- Wu, B., et al. Endocardial cells form the coronary arteries by angiogenesis through myocardial-endocardial VEGF signaling. Cell. 151, 1083-1096 (2012).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45, 593-605 (2007).
- Wu, M., et al. Epicardial spindle orientation controls cell entry into the myocardium. Dev Cell. 19, 114-125 (2010).
- Zhao, C., et al. Numb family proteins are essential for cardiac morphogenesis and progenitor differentiation. Development. 141, 281-295 (2014).
- Kaufman, M. H., Kaufman, M. H. . The atlas of mouse development. , (1992).
- Nagy, A. . Manipulating the mouse embryo : a laboratory manual. , (2003).
- Buckingham, M., Meilhac, S., Zaffran, S. Building the mammalian heart from two sources of myocardial cells. Nat Rev Genet. 6, 826-835 (2005).
- Kelly, R. G., Buckingham, M. E. The anterior heart-forming field: voyage to the arterial pole of the heart. Trends Genet. 18, 210-216 (2002).
- Verzi, M. P., McCulley, D. J., De Val, S., Dodou, E., Black, B. L. The right ventricle, outflow tract, and ventricular septum comprise a restricted expression domain within the secondary/anterior heart field. Dev Biol. 287, 134-145 (2005).
- Ward, C., Stadt, H., Hutson, M., Kirby, M. L. Ablation of the secondary heart field leads to tetralogy of Fallot and pulmonary atresia. Dev Biol. 284, 72-83 (2005).
- Echelard, Y., Vassileva, G., McMahon, A. P. Cis-acting regulatory sequences governing Wnt-1 expression in the developing mouse CNS. Development. 120, 2213-2224 (1994).
- Jiang, X., Rowitch, D. H., Soriano, P., McMahon, A. P., Sucov, H. M. Fate of the mammalian cardiac neural. Developement. 127, 1607-1616 (2000).
- Viragh, S., Challice, C. E. The origin of the epicardium and the embryonic myocardial circulation in the mouse. Anat Rec. 201, 157-168 (1981).
- Wu, M., Li, J. Numb family proteins: novel players in cardiac morphogenesis and cardiac progenitor cell differentiation. Biomolecular concepts. 6, 137-148 (2015).
- Li, J., et al. Single-Cell Lineage Tracing Reveals that Oriented Cell Division Contributes to Trabecular Morphogenesis and Regional Specification. Cell reports. 15, 158-170 (2016).
- Alkaabi, K. M., Yafea, A., Ashraf, S. S. Effect of pH on thermal- and chemical-induced denaturation of GFP. Appl Biochem Biotechnol. 126, 149-156 (2005).
- Captur, G., et al. Morphogenesis of myocardial trabeculae in the mouse embryo. J Anat. , (2016).
