הדמיה הותרה עוברית ולבבות אחרי לידה ברזולוצית תא בודד
Summary
We describe a protocol to volumetrically image fluorescent protein labeled cells deep inside intact embryonic and postnatal hearts. Utilizing tissue-clearing methods in combination with whole mount staining, single fluorescent protein-labeled cells inside an embryonic or postnatal heart can be imaged clearly and accurately.
Abstract
מעקב וניתוח המשובטים יחיד ברמה השלמה-לב יכולים לקבוע התנהגות תא ובתאי לב והבחנה במהלך התפתחות של לב, ולאפשר לחקר הבסיס התאי והמולקולרי של המורפוגנזה לב נורמלית נורמלית. טכנולוגיות מתפתחות אחרונות של ניתוחים משובטים יחיד רטרוספקטיבית לעשות לחקר המורפוגנזה לב ברזולוצית תא בודד ריאלית. עם זאת, אטימות רקמות אור פיזור של הלב כעומק הדמיה הוא גדל הדמיה כולו-לב לעכב ברזולוציה תא בודד. כדי להתגבר על המכשולים הללו, מערכת סליקת מחיטה עוברת שיכול להפוך בלב מאוד שקוף לתאורה וזיהוי שניהם חייבים להיות מפותח. למרבה המזל, בשנים האחרונות, מתודולוגיות רבות למערכות סליקה כל-אורגניזם כגון CLARITY, SCA le, SeeDB, ClearT, 3DISCO, מעוקב, DBE, באב ו PACT דווחו. מעבדה זו מעוניינת המנגנונים התאיים ומולקולריים של כרטיסmorphogenesis IAC. לאחרונה, הקמנו שושלת תא בודדת התחקות דרך ROSA26-Cre ERT2; ROSA26-קונפטי מערכת לתאי תווית בדלילות במהלך התפתחות של לב. התאמנו מספר מתודולוגיות כולו סליקה-העובר כולל Sca le ו מעוקב (ברור, קוקטיילי הדמיה מוחית בלא הפרעה וניתוח חישובית) כדי לנקות את העובר בשילוב עם מכתים הר שלם כדי שיבוטים יחידים תמונה בתוך הלב. הלב היה צלם בהצלחה ברזולוצית תא בודדת. מצאנו כי Sca le יכול לנקות את הלב העוברי, אך לא ניתן לנקות את הלב לאחר הלידה ביעילות, תוך מעוקב יכול לנקות את הלב לאחר הלידה, אך נזקים בלב העוברית על ידי המסת רקמות. השיטות שתוארו כאן תאפשרנה המחקר של תפקוד גן ברזולוצית שיבוט אחד במהלך המורפוגנזה לב, אשר, בתורו, יכול לחשוף את הבסיס התאי ומולקולרי של מומי לב מולדים.
Introduction
המורפוגנזה לב היא אירוע רציף הדורש ארגון spatiotemporal של ארבעה סוגים שונים של ובתאים לב למגזרים ברורים של הלב, וגם דורשת רשתות רגולטוריות גנטיות מרובות לתזמר את התהליך הזה כדי ליצור את 1,2 הלב הפונקציונלי. מפרט, בידול, דפוסי לב, והתבגרות קאמרית מוסדרים 3 גורמי שעתוק קרדיוגני. מוטציה גנטית או סטיית posttranscriptional של גורמים אלה ובתאי לב יכולה לגרום גם קטלני עובריים או מומי לב מולדים (CHD) 4. המחקר של המורפוגנזה לב דורש הבנה של פרטים מבניים טמונים בשלושה ממדים (3D) ואת שושלת תא אב לב יחידה שכותרתו התחקות במהלך התפתחות לב יקדם את ההבנה של המורפוגנזה לב. מספר שיטות טומוגרפיה מבוסס סעיף ברזולוציה גבוהה פותחו הדואר האחרונים עשרות שנים מבנה האיבר תמונה 5,6; עם זאת, שיטות אלו דורשות מכשירים יקרים, מיוחדים, עבודה רבה, ועל חוסר ארגון מבני מפורט ברזולוצית תא בודדת בתוך הנפח הסופי משוחזר תמונה 7,8.
הדמית נפח 3D ברמת התא הבודדה מספקת אמצעי ללמוד התמיינות תאים ובתאים והתנהגות הסלולר in vivo 7. עם זאת, פיזור אור הרקמות נשאר המכשול העיקרי הדמית תאים ומבני 3D עמוק בתוך הלב ללא פגע. ליפידים הם מקור עיקרי של פיזור אור, והסרת שומנים ו / או התאמה של ההבדל מקדם השבירה בין שומנים בסביבותיה שלהם גישות פוטנציאל להגדלת רקמת שקיפות 8. בשנים האחרונות, מספר שיטות סליקה רקמות פותחו, המקטינים אטימות רקמות פיזור אור, כמו באב (בנזיל אלכוהול ו benzoat בנזילתערובת ה) ו- DBE (tetrahydrofuran ו dibenzylether); אבל בשיטות האלה, מרווה הקרינה נשארת בעיה 8-10. הממס מבוסס שיטות הידרופילי, כגון SeeDB (פרוקטוז / thioglycerol) ו 3DISCO (dichloromethane / dibenzylether), לשמר אותות ניאון, אבל לא להפוך כל האיבר 7,8,11 שקוף. לשם השוואה, שיטת רקמות סליקת CLARITY הופכת את האיבר שקוף, אבל זה דורש מכשיר אלקטרופורזה מיוחד כדי להסיר שומנים 8,12, כפי שעושה PACT (טכניקת בהירות פסיבית), אשר גם דורשת הידרוג'ל הטבעת 7,13. לקבלת מידע מפורט לגבי כל שיטות ניקוי הרקמות הזמינות, עיין בטבלת 1 ב ריצ'רדסון ליכטמן, et al. 7.
בשנת 2011, חאמה et al. גילה serendipitously תערובת הידרופילי 'Sca le' (אוריאה, גליצרול טריטון תערובת X-100) אשר משבש את המוח העכבר transpar העובראף אוזן גרון תוך שמירת פלורסנט אותות לחלוטין שיבוטים שכותרתו 14. זה מאפשר הדמיה של המוח ללא פגע בעומק של כמה מילימטרים ושחזור בקנה מידה גדול של אוכלוסיות נוירונים ותחזיות ברזולוציה subcellular. Susaki et al. נוספים שיפרו Sca le ידי הוספת aminoalcohols ופיתח את 'מעוקב' (ברור, קוקטיילים הדמיה מוחית בלא הפרעה וניתוח חישובית) שיטת הסליקה רקמות, שהגדילה solubilization פוספוליפידים, זמן סליקה מופחת, ואיפשר פלורסנט ססגוניות הדמיה 8. במחקר הנוכחי, מנצל את Sca le וטכניקות סליקת רקמות מעוקבות חתך אופטי 3D ברזולוציה גבוהה, שיבוטי פרט בתוך הלב במהלך cardiogenesis אותר באמצעות Rosa26Cre ERT2 15, R26R-קונפטי 16, αMHC-Cre 17, cTnT-Cre 18, </strong> Nfatc1-Cre 19, ו Rosa26-mTmG (mTmG) 20 קווי עכבר. השילוב של מכתים הר השלם (WMS) השיטה שפותח בעבר 21,22 עם שיטות סליקת רקמות מותרות נוסף עבור המכתים של חלבונים אחרים שיבוטי שכותרתו לחקר התנהגותם בהקשר נפח 3D. השילוב של סליקת רקמות WMS מאפשר הבנה טובה יותר של התפקידים של גנים וחלבונים שונים במהלך התפתחות של לב, ואת האטיולוגיה של מומי לב מולדים. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם ללמוד התמיינות תאים ובתאים אחרות, התנהגות הסלולר, ואירועי morphogenesis האיבר במהלך פיתוח.
Protocol
Representative Results
Discussion
הבידוד העובר הוא צעד מאוד קריטי. עובר E9.5 הם שבירים מאוד קטנים בגודלם, כך משנת זהירות יש לנקוט לא לפגוע מבנים עוברים / לב במהלך בידוד. שני הרבדים הנוספים שאינם עובריים העוטף את העובר / הלב צריך להסיר בזהירות במיוחד כאשר הדמיה העובר כולו. זה מאפשר חדירת תערובת נוגדנים וסל…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank M.W. laboratory members for scientific discussion. This work is supported by AHA [13SDG16920099] to M.W., and by National Heart, Lung, and Blood Institute grants [R01HL121700] to M.W. Images were captured in the Imaging Core Facility at the Albany Medical College.
Materials
| 2,2′,2′’-nitrilotriethanol | Sigma Aldrich | 90279 | |
| 4% Paraformaldehyde in PBS | Affymetrix | 19943 | |
| BSA | Fischer Scientific | BP16000 | |
| N,N,N’,N’-tetrakis(2-hydroxypropyl) ethylenediamine | Sigma Aldrich | 122262 | |
| Phosphate Buffer Saline | Sigma Aldrich | P5368-10PAK | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Urea | Sigma Aldrich | U-1250 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | 84097 | |
| Glycerol | Sigma Aldrich | G8773 | |
| Tamoxifen | Sigma Aldrich | T5648 | |
| Sunflower seed oil | Sigma Aldrich | S5007 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P1379 | |
| PECAM (CD31) | BD Pharmingen | 550274 | |
| Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A-21247 | |
| DAPI nuclear stain | Sigma Aldrich | D9542 | |
| 37oC Incubator | Thermoscientific Fischer | Heratherm, Compact Microbiological Incubators | |
| 48 well plates | Cell Treat | 229148 | |
| Analytical Balance | Metler Toledo | PB153-S/FACT | |
| Confocal microscope | Zeiss | Zeiss 510 confocal microscope | |
| Disecting Microscope | Unitron | Z850 | |
| Fluorescent microscope | Zeiss | Observer. Z1 | |
| Germinator 500 Glass Bead Sterilizer | CellPoint Scientific | GER-5287-120V | |
| Light Source | SCHOTT | ACE I | |
| Pair of Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Petri dish 60x15mm | TPP Techno Plastic Products AG | 93060 | |
| Rocker II Platform Rocker | Boekel Scientific | 260350 | |
| Scintillating tubes | Fischer Scientific | 03-337-26 | |
| Transfer pipette | Samco Scientific | 202 | |
| Tweezers | Fine Science Tools | 11251-20 |
References
- Vincent, S. D., Buckingham, M. E. How to make a heart: the origin and regulation of cardiac progenitor cells. Curr Top Dev Biol. 90, 1-41 (2010).
- Olson, E. N. A decade of discoveries in cardiac biology. Nat Med. 10, 467-474 (2004).
- Olson, E. N. Gene regulatory networks in the evolution and development of the heart. Science. 313, 1922-1927 (2006).
- Bruneau, B. G. The developmental genetics of congenital heart disease. Nature. 451, 943-948 (2008).
- Mohun, T. J., Weninger, W. J. Embedding embryos for high-resolution episcopic microscopy (HREM). Cold Spring Harb Protoc. , 678-680 (2012).
- Soufan, A. T., et al. Three-dimensional reconstruction of gene expression patterns during cardiac development. Physiol Genomics. 13, 187-195 (2003).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162, 246-257 (2015).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157, 726-739 (2014).
- Becker, K., Jahrling, N., Saghafi, S., Weiler, R., Dodt, H. U. Chemical clearing and dehydration of GFP expressing mouse brains. PLoS One. 7, e33916 (2012).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nat Protoc. 7, 1983-1995 (2012).
- Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat Neurosci. 16, 1154-1161 (2013).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497, 332-337 (2013).
- Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158, 945-958 (2014).
- Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).
- Badea, T. C., Wang, Y., Nathans, J. A noninvasive genetic/pharmacologic strategy for visualizing cell morphology and clonal relationships in the mouse. J Neurosci. 23, 2314-2322 (2003).
- Livet, J., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450, 56-62 (2007).
- Agah, R., et al. Gene recombination in postmitotic cells. Targeted expression of Cre recombinase provokes cardiac-restricted, site-specific rearrangement in adult ventricular muscle in vivo. J Clin Invest. 100, 169-179 (1997).
- Jiao, K., et al. An essential role of Bmp4 in the atrioventricular septation of the mouse heart. Genes Dev. 17, 2362-2367 (2003).
- Wu, B., et al. Endocardial cells form the coronary arteries by angiogenesis through myocardial-endocardial VEGF signaling. Cell. 151, 1083-1096 (2012).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45, 593-605 (2007).
- Wu, M., et al. Epicardial spindle orientation controls cell entry into the myocardium. Dev Cell. 19, 114-125 (2010).
- Zhao, C., et al. Numb family proteins are essential for cardiac morphogenesis and progenitor differentiation. Development. 141, 281-295 (2014).
- Kaufman, M. H., Kaufman, M. H. . The atlas of mouse development. , (1992).
- Nagy, A. . Manipulating the mouse embryo : a laboratory manual. , (2003).
- Buckingham, M., Meilhac, S., Zaffran, S. Building the mammalian heart from two sources of myocardial cells. Nat Rev Genet. 6, 826-835 (2005).
- Kelly, R. G., Buckingham, M. E. The anterior heart-forming field: voyage to the arterial pole of the heart. Trends Genet. 18, 210-216 (2002).
- Verzi, M. P., McCulley, D. J., De Val, S., Dodou, E., Black, B. L. The right ventricle, outflow tract, and ventricular septum comprise a restricted expression domain within the secondary/anterior heart field. Dev Biol. 287, 134-145 (2005).
- Ward, C., Stadt, H., Hutson, M., Kirby, M. L. Ablation of the secondary heart field leads to tetralogy of Fallot and pulmonary atresia. Dev Biol. 284, 72-83 (2005).
- Echelard, Y., Vassileva, G., McMahon, A. P. Cis-acting regulatory sequences governing Wnt-1 expression in the developing mouse CNS. Development. 120, 2213-2224 (1994).
- Jiang, X., Rowitch, D. H., Soriano, P., McMahon, A. P., Sucov, H. M. Fate of the mammalian cardiac neural. Developement. 127, 1607-1616 (2000).
- Viragh, S., Challice, C. E. The origin of the epicardium and the embryonic myocardial circulation in the mouse. Anat Rec. 201, 157-168 (1981).
- Wu, M., Li, J. Numb family proteins: novel players in cardiac morphogenesis and cardiac progenitor cell differentiation. Biomolecular concepts. 6, 137-148 (2015).
- Li, J., et al. Single-Cell Lineage Tracing Reveals that Oriented Cell Division Contributes to Trabecular Morphogenesis and Regional Specification. Cell reports. 15, 158-170 (2016).
- Alkaabi, K. M., Yafea, A., Ashraf, S. S. Effect of pH on thermal- and chemical-induced denaturation of GFP. Appl Biochem Biotechnol. 126, 149-156 (2005).
- Captur, G., et al. Morphogenesis of myocardial trabeculae in the mouse embryo. J Anat. , (2016).
