Borrado de imágenes embrionario y postnatal Corazones en la Resolución de celda única
Summary
We describe a protocol to volumetrically image fluorescent protein labeled cells deep inside intact embryonic and postnatal hearts. Utilizing tissue-clearing methods in combination with whole mount staining, single fluorescent protein-labeled cells inside an embryonic or postnatal heart can be imaged clearly and accurately.
Abstract
Un solo trazado clonal y el análisis a nivel de todo el corazón pueden determinar el comportamiento de células progenitoras cardíacas y diferenciación durante el desarrollo cardíaco, y permitir el estudio de las bases celulares y moleculares de la morfogénesis cardíaca normal y anormal. Recientes tecnologías emergentes de los análisis retrospectivos clonales individuales hacen que el estudio de la morfogénesis cardíaca a una resolución de una sola célula viable. Sin embargo, la opacidad del tejido y dispersión de la luz del corazón como la profundidad de imagen se aumenta la imagen de todo el corazón obstaculizar a una resolución de una sola célula. Para superar estos obstáculos, un sistema de compensación de todo el embrión que puede hacer que el corazón de gran transparencia, tanto para la iluminación y detección deben ser desarrollados. Afortunadamente, en los últimos años, se han reportado muchas metodologías para sistemas de compensación de todo el organismo, tales como la claridad, le Sca, SeeDB, ClearT, 3DISCO, cúbico, DBE, Babb y PACT. Este laboratorio está interesado en los mecanismos celulares y moleculares de la tarjetamorfogénesis IAC. Recientemente, hemos establecido el linaje de células individuales de rastreo a través de la ROSA26-Cre ERT2; sistema de ROSA26-confeti a las células de la etiqueta escasamente durante el desarrollo cardíaco. Se adaptó varias metodologías integrales de embriones de compensación, incluida Sca-le-(y, cócteles de imágenes cerebrales sin obstáculos claros y análisis computacional) CÚBICAS para despejar el embrión en combinación con toda la tinción de montaje de imagen clones individuales dentro del corazón. El corazón fue fotografiada con éxito en la resolución de una sola célula. Se encontró que Sca le puede borrar el corazón embrionario, pero no puede limpiar con eficacia el corazón postnatal, mientras CUBIC puede limpiar el corazón postnatal, pero daña el corazón embrionario disolviendo el tejido. Los métodos descritos aquí permitirán el estudio de la función de genes en una sola resolución clon durante la morfogénesis cardíaca, la cual, a su vez, puede revelar las bases celulares y moleculares de los defectos congénitos del corazón.
Introduction
Morfogénesis cardíaca es un evento secuencial que requiere la organización espacio-temporal de cuatro tipos diferentes de células progenitoras cardíacas en sectores distintos del corazón, y también requiere múltiples redes de regulación genética para orquestar este proceso para formar la 1,2 corazón funcional. Cardiaco especificación, diferenciación, patrones, y la maduración de cámara están regulados por factores de transcripción cardiogénico 3. Mutación genética o la aberración postranscripcional de estos factores en las células progenitoras cardiacas podrían resultar en la letalidad embrionaria o defectos congénitos del corazón (CHD) 4. El estudio de la morfogénesis cardíaca requiere una comprensión de los detalles inherentes estructurales en tres dimensiones (3D) y solo linaje de células progenitoras cardíacas etiqueta de rastreo durante el desarrollo cardiaco promoverá la comprensión de la morfogénesis cardíaca. Una serie de métodos basados sección de tomografía de alta resolución se han desarrollado en THe últimos años, que la estructura del órgano de imagen 5,6; Sin embargo, estos métodos requieren instrumentos especializados, costosos y extensa de trabajo, y carecen de organización estructural detallado en la resolución de las células del volumétrica final de la imagen reconstruida 7,8.
De imagen volumétrica en 3D en el nivel de células individuales proporciona un medio para estudiar la diferenciación de células progenitoras y el comportamiento celular in vivo 7. Sin embargo, la dispersión de luz de tejido sigue siendo el principal obstáculo para imágenes de células y estructuras en 3D en el interior del corazón intacto. Los lípidos son una fuente importante de dispersión de la luz, y la eliminación de lípidos y / o el ajuste de la diferencia de índice de refracción entre los lípidos y sus alrededores son posibles enfoques para aumentar la transparencia del tejido 8. En los últimos años, se han desarrollado una serie de métodos de compensación de tejido, lo que reduce la opacidad del tejido y la dispersión de la luz, como Babb (alcohol bencílico y benzoato de bencilomezcla e) y DBE (tetrahidrofurano y dibenzylether); pero en estos métodos, extinción de fluorescencia sigue siendo un problema 8-10. El disolvente basa métodos hidrófilos, tales como SeeDB (fructosa / tioglicerol) y 3DISCO (diclorometano / dibenzylether), preservar señales fluorescentes, pero no hacen que el conjunto del órgano transparente 7,8,11. En comparación, el método de limpieza de tejido CLARITY hace que el órgano transparente, pero requiere un dispositivo de electroforesis especializado para eliminar los lípidos de 8,12, como lo hace PACT (técnica de claridad pasivo), que también requiere la incorporación de hidrogel 7,13. Para obtener información detallada acerca de todos los métodos de limpieza de tejidos disponibles, consulte la Tabla 1 en Richardson y Lichtman, et al. 7.
En 2011, Hama et al. Serendipitously descubrió una mezcla hidrófila 'Sca le' (urea, glicerol y Triton X-100 mezcla) que hace que el cerebro de ratón y embrión transparent preservando al mismo tiempo completamente señales fluorescentes a partir de clones marcados 14. Esto permite la formación de imágenes del cerebro intacto a una profundidad de varios milímetros y reconstrucción a gran escala de poblaciones neuronales y proyecciones con una resolución subcelular. Susaki et al. aún más mejorada Sca le mediante la adición de aminoalcoholes y desarrolló el (claras, cócteles sin obstáculos de imágenes cerebrales y análisis computacional) '' CÚBICAS método de compensación de tejido, lo que aumentó la solubilización de fosfolípidos, un reducido tiempo de compensación, y se deja para la imagen multicolor fluorescente 8. En el presente estudio, aprovechando la Sca LE y técnicas de limpieza y eliminación de tejido cúbico y alta resolución en 3D seccionamiento óptico, clones individuales dentro del corazón durante cardiogénesis se trazaron utilizando Rosa26Cre ERT2 15, R26R-confeti 16, αMHC-Cre 17, cTnT-Cre 18, </strong> NFATc1 Cre-19, y Rosa26-mTmG (mTmG) 20 líneas de ratón. La combinación del método de tinción conjunto de montaje (WMS) desarrollado previamente 21,22 con los métodos de limpieza y eliminación de tejido permitidos adicional para la tinción de otras proteínas en clones etiquetados y para el estudio de su comportamiento en un contexto volumétrica 3D. La combinación de la limpieza de tejidos y WMS permite una mejor comprensión de las funciones de los diferentes genes y proteínas durante el desarrollo cardiaco, y la etiología de los defectos congénitos del corazón. Este protocolo se puede aplicar para estudiar otra diferenciación de células progenitoras, el comportamiento celular, y eventos morfogénesis de órganos durante el desarrollo.
Protocol
Representative Results
Discussion
El aislamiento de embriones es un paso muy crítico. E9.5 embriones son muy frágiles y de tamaño pequeño, por lo que la atención deberá tener precaución de no dañar las estructuras del embrión / corazón durante el aislamiento. Las capas adicionales no embrionarias que envuelve el embrión / corazón deben eliminarse cuidadosamente mediante la formación de imágenes sobre todo cuando todo el embrión. Esto permite la penetración mezcla de anticuerpos y la limpieza en el interior de los tejidos embrionarios, y …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank M.W. laboratory members for scientific discussion. This work is supported by AHA [13SDG16920099] to M.W., and by National Heart, Lung, and Blood Institute grants [R01HL121700] to M.W. Images were captured in the Imaging Core Facility at the Albany Medical College.
Materials
| 2,2′,2′’-nitrilotriethanol | Sigma Aldrich | 90279 | |
| 4% Paraformaldehyde in PBS | Affymetrix | 19943 | |
| BSA | Fischer Scientific | BP16000 | |
| N,N,N’,N’-tetrakis(2-hydroxypropyl) ethylenediamine | Sigma Aldrich | 122262 | |
| Phosphate Buffer Saline | Sigma Aldrich | P5368-10PAK | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Urea | Sigma Aldrich | U-1250 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | 84097 | |
| Glycerol | Sigma Aldrich | G8773 | |
| Tamoxifen | Sigma Aldrich | T5648 | |
| Sunflower seed oil | Sigma Aldrich | S5007 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P1379 | |
| PECAM (CD31) | BD Pharmingen | 550274 | |
| Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A-21247 | |
| DAPI nuclear stain | Sigma Aldrich | D9542 | |
| 37oC Incubator | Thermoscientific Fischer | Heratherm, Compact Microbiological Incubators | |
| 48 well plates | Cell Treat | 229148 | |
| Analytical Balance | Metler Toledo | PB153-S/FACT | |
| Confocal microscope | Zeiss | Zeiss 510 confocal microscope | |
| Disecting Microscope | Unitron | Z850 | |
| Fluorescent microscope | Zeiss | Observer. Z1 | |
| Germinator 500 Glass Bead Sterilizer | CellPoint Scientific | GER-5287-120V | |
| Light Source | SCHOTT | ACE I | |
| Pair of Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Petri dish 60x15mm | TPP Techno Plastic Products AG | 93060 | |
| Rocker II Platform Rocker | Boekel Scientific | 260350 | |
| Scintillating tubes | Fischer Scientific | 03-337-26 | |
| Transfer pipette | Samco Scientific | 202 | |
| Tweezers | Fine Science Tools | 11251-20 |
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