The assembly and positioning of the mitotic spindle depend on the combined forces generated by microtubule dynamics, motor proteins and cross-linkers. Here we present our recently developed methods in which the geometrical confinement of spherical emulsion droplets is used for the bottom-up reconstitution of basic mitotic spindles.
Mitotic spindle assembly, positioning and orientation depend on the combined forces generated by microtubule dynamics, microtubule motor proteins and cross-linkers. Growing microtubules can generate pushing forces, while depolymerizing microtubules can convert the energy from microtubule shrinkage into pulling forces, when attached, for example, to cortical dynein or chromosomes. In addition, motor proteins and diffusible cross-linkers within the spindle contribute to spindle architecture by connecting and sliding anti-parallel microtubules. In vivo, it has proven difficult to unravel the relative contribution of individual players to the overall balance of forces. Here we present the methods that we recently developed in our efforts to reconstitute basic mitotic spindles bottom-up in vitro. Using microfluidic techniques, centrosomes and tubulin are encapsulated in water-in-oil emulsion droplets, leading to the formation of geometrically confined (double) microtubule asters. By additionally introducing cortically anchored dynein, plus-end directed microtubule motors and diffusible cross-linkers, this system is used to reconstitute spindle-like structures. The methods presented here provide a starting point for reconstitution of more complete mitotic spindles, allowing for a detailed study of the contribution of each individual component, and for obtaining an integrated quantitative view of the force-balance within the mitotic spindle.
خلال الانقسام، ويتم تنظيم الكروموسومات من الجينوم تكرارها عند خط الاستواء خلية لضمان التوزيع العادل للالصبغي الشقيقة على الخلايا الوليدة التي شكلت حديثا. وتوسط المواقع كروموسوم والعزل من قبل تمسكهم ميكروتثبول المغزل القادمة من اثنين جسيم مركزي معارضة. وبالإضافة إلى ضمان توزيع كروموسوم المؤمنين، واتجاه محور الدوران الإنقسامية أيضا يملي انقسام الخلايا طائرة 1. توجه المنسق لانقسام الخلية ضروري خلال مراحل عديدة من التنمية وللتوازن الأنسجة 2. على وجه التحديد، يمكن أن ينظم الإنقسامية المغزل المواقع يؤدي إلى التوزيع غير المتماثل المحتويات الخلوية أو حتى تنتج الخلايا الوليدة من مختلف الأحجام 2. يبدأ الإنقسامية الجمعية المغزل والتوجيه في الطور الأول ومدبرة من قبل تفاعل معقد بين التعاون واستعداء القوى مولدات 3،4. تتكون القوات المتولدة من بسحب ودفع القوات أوراسكوم تليكوم القابضة. هذه القوى تنبع سواء من الاتصالات المغزل مع قشرة الخلية وكذلك من داخل المغزل، ويمكن توليدها عن طريق ديناميات أنيبيب فضلا عن المحركات الجزيئية وlinkers عبر (الشكل 1).
القوى التي تدفع يمكن أن تتولد عندما تنمو الأنابيب الدقيقة ضد المنشآت جامدة مثل قشرة الخلية. اعتمادا على مجموع قوة مقاومة المتولدة داخل النظام، وهذا يمكن أن يؤدي إلى إعادة تنظيم المغزل الإنقسامية (القوات منخفضة) أو يؤدي الى التواء أنيبيب أو كارثة (قوات عالية) 5-8. مقدار القوة التي يمكن توليدها عن طريق دفع يعتمد على طول أنيبيب، منذ مدة هو حاسما بشكل قوي في أنيبيب-يرزح 9. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن الأنابيب الدقيقة التي تنشأ من جسيم مركزي واحد يدفع على الجسيم المركزي الآخر، وهو الآلية التي تم اقترح أن يقود الفصل الجسيم المركزي في أوائل الطور 3،10.
في الإعلانdition لدفع القوى التي تولدها الأنابيب الدقيقة المتزايد، أنيبيب ينتهي اتصالات مع قشرة الخلية يمكن أن توسط أيضا سحب القوات 11. وقد أظهرت الدراسات من مختبرات متعددة النشاط تسيطر المولدات قوة القشرية مطلوب لتحديد المواقع غير المتماثلة من مغزل الإنقسامية في الجسم الحي 1. من الضروري لهذه التجاذبات غير مترجمة القشرة داينين حشوية (يشار إليها فيما يلي باسم "داينين ')، على حد ناقص أنيبيب موجهة البروتين السيارات 8،12،13. على سبيل المثال، في مهدها الخميرة، والتفاعلات الجانبية للداينين القشرية مع نتيجة شعرية أنيبيب في أنيبيب التي تعتمد على محرك الانزلاق على طول القشرة 14. ومع ذلك، التجاذبات القشرية ويمكن أيضا أن تتولد عن قدرة داينين لتشكيل إرفاق ملفات نهاية إلى depolymerizing الأنابيب الدقيقة 8. الطاقة المتولدة عن انكماش أنيبيب قد تؤدي إلى القوى التي عادة ما تكون لحجم أعلى (~ 50 السندات الإذنية (مرجع 15 </sتصل>)) من القوى التي تولدها البروتينات الحركية الفردية (~ 7-8 السندات الإذنية (المرجع 16)). التعلق نهاية يوم من داينين القشرية إلى الأنابيب الدقيقة depolymerizing يعزز المواقع المغزل في مهدها الخميرة 17 و C. ايليجانس 13. سواء على حد سواء انزلاق تعتمد على المحركات وأنيبيب التحلل مدفوعة التجاذبات القشرية أن تتعاون أو لا يجتمعان في الجسم الحي هو في المجهول الحالي.
بالإضافة إلى القوى التي تدفع أنيبيب والتجاذبات القشرية بوساطة داينين، يتم التحكم المواقع الجسيم المركزي من داخل المغزل الإنقسامية من قبل العديد من البروتينات الأخرى. كينيسين 5 المحركات، وعلى سبيل المثال، كما توجد tetramers التي يمكن عبور الارتباط الأنابيب الدقيقة بين القطبين التوازي، مما أدى إلى جيل من القوات انزلاق نحو الخارج 18-20. ويلزم أعضاء الأسرة المحرك كينيسين-5 للفصل الجسيم المركزي والجمعية المغزل القطبين في جميع حقيقيات النوى درس، باستثناء C. ايليجانس (إعادة النظر في المرجع 21).
وعلاوة على ذلك، ومن المعروف إنتشاري linkers العرضية للأسرة / PRC1 Ase1 أيضا إلى توطين لتداخل المناطق أنيبيب من الأنابيب الدقيقة بين القطبين في المجراة في المختبر 22-27. القوى التي تولدها التوسع مدفوعة Ase1 للتداخل أنيبيب-منطقة كبيرة بما يكفي لموازنة كينيسين 14 بوساطة القوات انزلاق في المختبر 28،29. في الخلايا، مطلوب Ase1 / PRC1 لتشكيل مستقر للتداخل المناطق أنيبيب في midzone المغزل 25-27،30، مما يشير إلى أن القوى التي تولدها إنتشاري linkers عبر يمكن أن يساهم إلى حد كبير في تنظيم المغزل. وأخيرا، قوات من لونين الإنقسامية وkinetochores تؤثر الجمعية المغزل الإنقسامية وتحديد المواقع من خلال مختلف مسارات 3. وبما أن هذه العناصر ليست جزءا من المقايسات إعادة الموصوفة هنا، أنها لن تناقش بالتفصيل.
jove_content "> نظريات مختلفة موجودة على كيفية المكونات والقوى الجزيئية المختلفة المذكورة أعلاه تتعاون في التجمع المغزل وتحديد المواقع، لكننا لا نزال بعيدين عن فهم الكمي. وبالإضافة إلى التجارب في الخلايا الحية، في التجارب المختبرية مع مكونات النقاء توفر قوية الطريق للمساعدة في تحقيق هذا الهدف، وهنا نقدم دليل البصرية إلى صيغة معدلة وموسعة من الطرق التي نشرت مؤخرا (روث وآخرون. 31)، التي يتم فيها إعادة تشكيل مغزل الأساسية في قطرات مستحلب الماء في النفط، بدءا من أقل عدد ممكن من المكونات. وباستخدام تقنيات الموائع الدقيقة، يتم إنشاء قطرات كروية مع الأحجام التي يمكن مقارنتها مع الخلايا الإنقسامية. وضمن هذه القطرات، جسيم مركزي النقاء وتويولين يمكن الجمع بين لدراسة ديناميات أستر أنيبيب، وقوة جيل وأستر-أستر التفاعلات. بواسطة إدخال القشرية (مثل داينين) وبين القطبية (مثل كينيسين 5 / Ase1) قوة المولدات الكهربائية، ونحنإعادة تشكيل هياكل مثل مغزل تزداد تعقيدا أن تبدأ اشبه الوضع في الجسم الحي.ووصفت وسائل الجهود الحالية هنا مؤخرا لإعادة مغزل الإنقسامية الأساسية في قطرات مستحلب الماء في النفط. دراسة الجمعية المغزل داخل حدود هندسية يوفر مزايا عديدة. وتوجد آليات التغذية المرتدة هامة بين الأنابيب الدقيقة للمغزل الإنقسامية والقيود الهندسية التي يتم تجميعها. يمكن الأنابيب الدقيقة تولد دفع القوات عندما ينمو إلى الحدود الهندسية، والتي يمكن أن تؤدي إلى تشريد المغزل الإنقسامية. وبالإضافة إلى ذلك، وتزايد إلى حاجز مادي يمكن أن تحدث كوارث أنيبيب. أيضا، الجمعية المغزل في هندسة تقتصر يمكن أن يؤدي إلى نضوب التدريجي من المكونات الفردية، مثل تويولين، وهذا بدوره يؤثر بشكل مباشر على معدل النمو أنيبيب 36. وهذه كلها محددات أساسية من الجمعية المغزل، والتي يمكن دراستها باستخدام المقايسات وصفها هنا.
المقايسات وصفها هي حساسة جدا لاح تركيز صغيرالامتحانات التنافسية الوطنية من مكونات قطرة. هذا هو الحال بالنسبة لتويولين، حيث الاختلافات الطفيفة تركيز يمكن أن يؤدي إلى إما بطيئة جدا أو سريع جدا النمو أنيبيب. في هذه الحالة، يمكن في كثير من الأحيان لا يزال يتم تصحيح معدلات النمو أنيبيب عن طريق ضبط درجة الحرارة خلال أول دقيقة ~ 30 من هذه التجربة. حساس جدا لتغيرات في تركيز مولدات (القشرية) القوة أيضا الإنقسامية الجمعية المغزل وتحديد المواقع. هذا ومن المرجح أن تعتمد على التركيز والنقاء والنشاط من عناصر النقاء وتحتاج إلى معاير بعناية لكل البروتين المنقى حديثا.
وبالإضافة إلى ذلك، يجب أن تتم في أماكن التصوير، وهذا يتوقف على طبيعة الفحص بعض المقايضات. في البداية، وارتفاع مستويات قابلة للذوبان dimers تويولين الفلورسنت تجعل من الصعب صورة الأنابيب الدقيقة الفردية. كما الأنابيب الدقيقة تنمو أطول ونفاد تويولين للذوبان ببطء، ونسبة الإشارة إلى الضوضاء يصبح تدريجيا العالي ويسمح التصوير من individuآل الأنابيب الدقيقة. وعلى النقيض من الاجهزة مع الأنظمة المفتوحة، والحبس هندسي يمنع تبادل جزيئات الفلورسنت ومكونات النظام الأوكسجين زبال داخل الخزان بكميات كبيرة، مما يؤدي إلى تبييض كبير. خاصة لرصد الجمعية المغزل وتحديد المواقع مع مرور الوقت، هو مطلوب منها صورة مع شدة الإضاءة الخافتة، حتى في وجود نظام الأوكسجين زبال قوية.
تمكن هذه الطرق إعادة من أسفل إلى أعلى تبسيط الهياكل المغزل تشبه في المختبر. وبالإضافة إلى المكونات قدم هنا، وقد وصفت العديد من العوامل الأخرى للتأثير على تشكيل ثنائي القطب المغزل، وتحديد المواقع، والتوجه لتشكيل، الخ. 3. هذا النظام يمكن توسيع نطاقها لدراسة الآثار الفردية والمشتركة للمولدات قوة إضافية. هامة تسهم في تشكيل المغزل التي هي غائبة حاليا من هذا النظام هي الكروموسومات الإنقسامية. وقد تبين لونين الإنقسامية لتشكيل المغزل المباشر من قبل (1) chromokinesins التي يمكن أن تولد ما يسمى "قوات القطبية طرد" 3، (2) تشكيل التدرج RanGTP من قبل محددة لونين RanGEF RCC1 38، (3) kinetochores التي يمكن أن تتفاعل مع (depolymerizing ) الأنابيب الدقيقة 39 و(4) لونين نفسها، والتي يمكن أن تكون بمثابة ربيع الميكانيكية في الفترات الفاصلة بين الأنابيب الدقيقة معارضة 40.
وأخيرا، يقدم النظام المذكور حاليا السيطرة الزمانية والمكانية محدودة على النشاط وتوطين عرض قوة المولدات الكهربائية. في الخلايا، العديد من العوامل الجمعية المغزل توطين لمقصورات محددة أو تنشط في غضون فترة زمنية نافذة مقيدة. ومن الأمثلة الصارخة على نشاط داينين، الذي أثرى تحديدا في الجانب الخلفي من C. ايليجانس خلية واحدة مرحلة الجنين إلى تعزيز غير المتماثلة المواقع المغزل وانقسام الخلايا. في هذا النظام، ونحن حاليا بصدد استكشاف إمكانية محاكاة هذا رالنشاط باستخدام أساليب emporal وغير المتماثلة اقترضت من تقنيات البصريات الوراثية. وبالإضافة إلى ذلك، كما هو الحال بالنسبة لجيم ايليجانس الجنين والخلايا بجدار الخلية جامدة، والعديد من الخلايا لا محاصرة في الانقسام. وشكل هندسي الحبس يكون له تأثير جوهري على القوى المؤثرة على محور 41. ولذلك سيكون من المهم إعادة الجمعية المغزل وتحديد المواقع في قطرات غير كروية كذلك، وربما باستخدام نظم ميكروفلويديك أكثر تعقيدا التي تتيح تشكيل وتخزين مستحلب قطرات 42،43. وأخيرا، في الأنسجة، خلية خلية وإشارات الخلية الركيزة والتعلق توفر منبهات الخارجية التي يمكن أن تترجم إلى التوجه المغزل توجيهها، إذ أن كثيرا ما لوحظ في الخلايا الظهارية والخلايا الجذعية. لم تؤخذ جميع هذه الجوانب المتخصصة بعين الاعتبار في هذه الدراسة الحالية وربما يوفر التحديات المستقبلية لبناء نحو مزيد في الجسم الحي تشبه reconstitutions من assemb المغزل الإنقساميةلاي وتحديد المواقع.
The authors have nothing to disclose.
We like to thank the members of the Dogterom lab for valuable discussions. We acknowledge Stefan Diez and Marcel Janson for reagents, and Samara Reck-Peterson for help with the purification of dynein. This work was supported by funding from the European Research Council (ERC Synergy grant: MODEL-CELL).
1. Preparation of microfluidic chips | |||
Photomask (Photomask on film substrate) | Selba S.A. Switzerland | ||
SU-8 3025 | MicroChem | ||
Silicon wafer (4 inch silicon wafer p/Boron <1-0-0> 10-20 Ω-cm, 500-550μm, SSP, w/2 flats) | WRS Materials | 4P0SSP-005 | |
Spin coater | Polos | SPIN150I | |
PDMS pre-polymer RVT615 A+B | Lubribond | 9481 | |
Corona treater | Electro-technic products | BD-20ACV | |
2. Microfluidic setup | |||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
DOPS (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine) | Avanti Polar Lipids | 840035 | |
Biotinyl PE (1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(biotinyl)) | Avanti Polar Lipids | 870285 | |
Chloroform | Sigma-Aldrich | 650498 | |
Glass pipets | |||
Glass tubes | |||
Vacuum pump | Laboport | KNF | |
Vacuum chamber | Kartell | Polypropylene Vacuum Desiccator | |
Mineral oil | Sigma-Aldrich | M5904 | |
Surfactant (Span80) | Sigma-Aldrich | 85548 | |
Sonicator | Branson | M2800H | |
Coverslips | 24x60mm, thickness 1.5 | ||
Glass-slides | 26x76mm | ||
Puncher | Harris Uni-Core | 135840/135841/135843 | |
Laboratory sealing film | Parafilm | ||
Valap (Vaseline, lanolin, paraffin wax melted at equal concentrations) | Home made | ||
Brightfield Microscope | Leica | PMIRB | Any inverted brightfield would suffice |
Pressure controler | Fluigent | MFCS-FLEX-4C-1000 | |
PEEK Tubing | Cluzeau Info. Labo, France | ||
Microfluidics vials (Tubes Micrew 0.5 ml and 1 ml) | VWR, The Netherlands | ||
3. Reconstituting spindle formation and positioning | |||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Dextran-647nm (Dextran, Alexa Fluor 647, 10,000 MW, Anionic, Fixable) | Life Technologies | ||
Tween-20 | Sigma-Aldrich | ||
BSA – Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | ||
Glucose (D-(+)-Glucose) | Sigma-Aldrich | G8270 | |
Glucose-oxidase (Glucose oxidase from Aspergillus niger) | Sigma-Aldrich | G6125 | |
DTT (DL-dithioltheitol) | Sigma-Aldrich | 646563 | |
Catalase (Catalase form bovine liver) | Sigma-Aldrich | C9322 | |
Tubulin (Tubulin from bovine brain) | Cytoskeleton Inc. | ||
Tubulin-488/561 (HiLyte-488/Rhodamine-labeled tubulin from porcine brain) | Cytoskeleton Inc. | ||
GTP (Guanosine-'5-triphosphate, sodium salt hydrate) | Sigma-Aldrich | 51120 | |
κ-casein (κ-casein from bovine serum milk) | Sigma-Aldrich | C0406 | |
Airfuge (Air-driven ultracentrifuge) | Beckman-Coulter | CLS | |
4. Introducing spindle-assembly factors | |||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Neutravidin | Sigma-Aldrich | A2666 | |
ATP (Adenosine-'5-triphosphate, disodium salt hydrate) | Sigma-Aldrich | A9187 | |
PEP (Phospho(enol)pyruvic acid monosodium salt hydrate ≥ 97% (enzymatic)) | Sigma-Aldrich | P0564 | |
PK/LDH -(Pyruvate kinase/lactic dehydrogenase enzymes from rabbit muscle) | Sigma-Aldrich | P0294 |