球状​​エマルジョン液滴での基本的な紡錘体の再構成

マイクロ流体チップの作製注：スピンドルアセンブリのボトムアップ研究のために、球状の油中水型エマルジョン液滴が使用されます。これらは、リン脂質と界面活性剤の単層によって周囲の油相から分離し、水性微小液滴です。これらのエマルジョンの液滴は、マイクロ流体、ポリジメチルシロキサン（PDMS）チップ内で生成されます。チャネルの形状および流量の変化は、調整液滴サイズに使用することができます。ここで説明するマイクロ流体設計では、液滴は、哺乳類の有糸分裂細胞の幾何学的な閉じ込めを模倣するために約15μm​​の直径で生成されます。 フォトマスクの設計・金型製作 3の入口チャネル31を含むフォトマスクを設計します。入口チャネル1は、（「基本的な微小管アスターを再構成する」のセクション3を参照）、液滴の内容が含まれている水相に接続します。入口チャネル2は、油相（see節2.1「脂質/油-PHAに接続しますSEの準備」）。観察（オプション）（ 図2a-bの前に追加の脂質/油相とのエマルジ ​​ョン液滴を希釈するために導入路3を使用してください）。 注：すべての入口チャネルがトラップほこり、PDMS粒子と（タンパク質）の凝集体に防塵フィルタ（2ミクロンのチャネルの迷路）が続いているとマイクロ流体チャネル（ 図2d）を遮断するからそれらを防ぐために。チャンネルは、75ミクロン幅で、乳化液滴が（ 図2c）を形成する12.5ミクロン幅の広い接合部の脂質/油相と水相出会います。 負極性で（フォトマスクが透明に設計された構造と暗くなる）、注文し、フィルム基板上に印刷されたフォトマスクを得ます。 金型製作クリーンルーム環境でスピンコーター（1800rpmで続いて500rpm、10秒、45秒）を使用して、4インチのシリコンウェハ上にスピンコートSU-8 3025フォトレジストで金型を製作してください。 SU-8コーティングされたを公開フォトマスクを介してシリコンウェハ。 〜40ミクロ​​ンの厚さのチャネルを作成するには、製造元の指示に従ってウェーハを開発します。 マイクロ流体チップを作りますプラスチック製のスパチュラを用いてボート型容器に1部硬化剤（合計〜40グラム）と10部のPDMSプレポリマーを混ぜます。約30分間の真空チャンバ内のボート状容器を含む場所PDMS。気泡を除去します。エッジを直立〜1センチメートルとのカップを形成する金型の周りにアルミホイルを包みます。 金型にPDMS（全容積の〜75％）を注ぎ、別〜30分間、真空チャンバー内に残します。 （気泡を除去するため）、オーブン中で100℃で1時間硬化させます。 スピンコート100℃で1時間硬化させたガラススライド上に残ったPDMS（4,000 rpmで30秒間、続いて200rpmで5秒）。圧縮空気/ N 2 -flowは、前洗浄を必要としない使用してガラススライドからほこりを取り除きます。 注：PDMS被覆したガラススライドを、両方のマイクのために使用することができますrofluidicチップおよびフローセル生産（また、2.2を参照のこと）。 軽く数秒間の実験室コロナ表面処理機を使用して.Corona-治療マイクロ流体チップ及びPDMSコーティングされたガラススライド（インレット用0.5ミリメートル、コンセントの0.75ミリメートル）カミソリの刃を用いて、金型のオフにPDMSを除去し、穴を開け。 スライドガラス（下に向けチャンネル）上にマイクロ流体チップを置き、O / N 100°C（ 図3a）でチップを焼きます。ほこりのない環境で、数ヶ月のためのマイクロ流体チップを保管してください。 2.マイクロ流体セットアップ注：油中水型エマルション滴がマイクロ流体セットアップ、上述のマイクロ流体チップを使用して生成されます。脂質/油相の組成は、実験条件に応じて変化させることができます。油溶化脂質は、内部に水に面し、その極性頭部基を有する水 – 油界面で単分子層を形成します。タンパク質を標的化するために（ 例えばダイニン）液滴境界に、ビオチニルホスファチジルエタノールアミン（ビオチニル-PE）脂質の低量を追加することができます。これは、ストレプトアビジン媒介多量体を経由して（セクション4.1「液滴皮質へのターゲティングダイニン」を参照）、ビオチン化ダイニンの動員を可能にします。液滴は界面活性剤を添加することによって安定化し、PDMSコーティングされたフロー・セルに格納されています。 脂質/油相の調製 （広く前クロロホルムピペットをリンスガラスピペットを用いてガラス管中：1のモル比4でクロロホルムに溶解し、1,2- dioleoyl- SN-グリセロ-3-ホスホ-L-セリン（DOPS）およびビオチニル-PE脂質を混合つかいます）。 〜0.5 mg / mlでの脂質濃度で、その結果、〜250μgの脂質の合計を準備します。 注意深くN 2 -flowて脂質混合物を乾燥し、続いて約1時間、真空チャンバです。 0.5mg / mlの（〜500μLを加える）に鉱油と2.5％界面活性剤中で乾燥した脂質を溶解します。 中の脂質/油試料を置き、超音波浴で30分間超音波処理。 40 kHzで完全に脂質を溶解します。 フローセルの準備スピンコートPDMSカバーガラスの上に（4000 rpmで30秒間、続いて200rpmで5秒）（また、セクション1.3を参照）、ガラススライド均質な層を堆積させるために（30秒間1500rpmで、続いて100rpmで5秒） PDMSの。 注：最適な撮像品質を得るには、顕微鏡の対物レンズと一致​​する厚さでカバーガラスを使用してください。この場合：1.5（〜0.17ミリメートル）。 オーブン中で100℃で1時間、PDMSコーティングされたカバーガラスとスライドガラスを治します。密接に間隔によってフローセルを作る（〜2ミリメートル）実験用封止膜の薄いスライス（〜幅3mm）PDMSコーティングされたガラススライド上。埃のない環境で保存した場合、使用されていないチャネルは、他の時間に使用することができます。 〜1分実験用封止膜を溶融することにより、PDMSコーティングされたカバーガラスとシールでフローセルをカバー。 100℃で、プレス優しく（ 図3c）。 Valap（ 図3c）で実験用封止膜-ガラス-境界を閉じます。ほこりのない環境での数ヶ月のためのストアフローセル。 PDMSカップの準備長期的なイメージングのために、PDMSのスライス（〜3mm厚）で直径4mmの穴を打ち抜いて、PDMSカップを作ります PDMSスライスとPDMSコーティングされたカバーガラスをコロナ処理し、互いの上にそれらを配置。 O / N（100℃で）PDMSカップ（ 図5a）焼きます。 エマルジョン液滴の形成倒立明視野顕微鏡での液滴形成を監視します。 （ 図3a）：PEEKチューブ（510ミクロン（外側）と125ミクロン（内側）直径）を使用して、マイクロ流体チップに圧力コントローラを接続します。入口2からの脂質/油相で完全にマイクロ流体チップを埋めます。 MRB80ベースの水相を導入（セクション3「再構成する基本的な微小管アスターを参照してください。4;）入口1.コントロール滴サイズから直径（ 図3b）で〜15ミクロンの液滴を作成するには、脂質/油相と水相の圧力を変化させることでは。 注：この設定を使用して、所望のサイズの液滴を作成するために、水相のための脂質/油相と〜200ミリバールのために〜800ミリバールを使用します。 所望の液滴サイズと必要な量（サンプル当たり〜10μl）を取得した後、出口チャネルから液滴を収集し、（完全にフローセルを記入）フローセルにロードします。 慎重Valapを使用してフローセルの両端を閉じます（不完全クローズドフロー細胞は、画像彼らにそれを困難に、液滴の大規模な運動をもたらすことができます）。また、液滴の移動を生じる気泡の形成を防止します。 サンプルの交差汚染や目詰まりを防止するために、前と使用後にイソプロパノールで徹底的にPEEKチューブを洗浄します。 3.再構成する基本的な微小管アスター注：実験の要件に応じて液滴の内容を変化させることができます。すべての緩衝液はMRB80ベース（80ミリモルPIPES、1mMのEGTA、4mMのMgCl 2を液（pH 6.8））であり、すべてのサンプルを氷上で調製します。一般的には、液滴は常に中心体、微小管重合、脱酸素剤システムとブロッキング剤に必要なコンポーネントが含まれている（3.1節を参照）。必要であれば、微小管の力発電機と、必要な補因子および標的因子を含めることができます（セクション4.1と4.2を参照してください）​​。 エマルジ ​​ョン液滴中アスター形成のための一般的なセットアップ（ 図3d） -80℃で小分けに予め、店舗内のグルコースオキシダーゼ（200mMのDTTおよび10mg / mlのカタラーゼ中の20mg / mlのグルコースオキシダーゼ）ミックスを調製します。 小さ ​​なaliquo予め、店舗内（ 表1参照）（中性マーカーとして）κカゼイン、ウシ血清アルブミン（BSA）、ツイーン20および蛍光デキストランを含有する「ブロッキングミックス'を調製します-80℃でのts。凍結融解の繰り返しを防ぎます。すべてのコンポーネントが新たに調製していることを確認します。 少量ずつ-150℃でMoudjou ら 32や店舗によって記載されているようなヒトリンパKE37細胞株由来の中心体を精製します。 室温で中心体を解凍し、〜37℃で20分間インキュベートします。使用前に適切な微小管の核形成を確保します。 注：これは実験中の微小管の核形成を促進します。 尚、チューブリン（蛍光および「暗い」）、グアノシン三リン酸（GTP）、酸素スカベンジャー系を含む、「アッセイミックス 'を調製する（グルコース、グルコースオキシダーゼ、カタラーゼおよび1,4-ジチオスレイトール（DTT））、分子力発生器（ 例えば、微小管モーター/架橋剤）、アデノシン三リン酸（ATP）とATP再生系（ホスホエノールピルビン酸（PEP）、ピルビン酸キナーゼ（PK）および乳酸デヒドロゲナーゼ（LDH））、氷上で（ 表2参照）。 事前冷却氷上でairfugeローター。冷却airfugeローター（3分30 PSI）.Add予備加熱した中心体（1-2中心体を含む液滴を目指すために中心体の量を最適化）でサンプルをスピンダウン。 2.3節で説明した方法を用いて乳化液滴を生成するために結合ミックスを使用してください。 成分 ストック濃度 最終濃度（アッセイ中） ボリューム コメント デキストラン、647nm 75μM 3.75 uMの（0.6μM） 5μlの κカゼイン 20 mg / mlで 12.5 mg / mlで（2 mg / mlで） 62.5μlの Tween-20を 5％ 0.375パーセント（0.06％） </TD> 7.5μlの BSA 200 mg / mlで 12 mg / mlで（1.9 mg / mlで） 6μlの MRB80 19μlの 100μlの最終 2μlの分量を保存します 表 1：「ミックスブロッキング」の成分混合物をブロックの成分、油中水型エマルジ ​​ョン滴における紡錘状構造の再構成のために必要。詳細については、「基本的な微小管アスターを再構成する「メインテキストセクション3を参照してください。材料の詳細については、「 材料表を参照してください。 成分 在庫concentration個 最終濃度 ボリューム コメント ブロッキングミックス 1.6μlのチューブリン 500μM 30μM 0.6μlのチューブリン-561分の488 50μM 3μM 0.6μlの GTP 50 mMの 5 mMの 1.0μlのダイニン-TMR 178 nMの 30 nMの 1.7μlのストレプトアビジン 5 mg / mlで 200 nMの 0.4μlの皮質ダイニンの場合のみキネシン-5 1.6 mMの 80 nMの 0.5μlの ATP 25 mMの 1 mMの 0.4μlのモータの場合のみ PEP 0.5 M 25.6 mMの 0.5μlのモータの場合のみ PK / LDH 800 U / 1100 U 23 U / 32 U 0.3μlのモータの場合のみ ASE1-GFP 400 nMの 80 nMの 2.0μlのグルコース 2.5 M 50 mMの 0.3μlの最終段階グルコースオキシダーゼ 50倍 1.0倍 0.3μlの最終段階 MRB80 バツ 9μlの最終 表 2：「アッセイミックス」の成分。 </strong>油中水型エマルジョンの液滴中の紡錘状構造の再構成に必要なアッセイ混合物の成分。詳細については、「基本的な微小管アスターを再構成する「メインテキストセクション3を参照してください。材料の詳細については、 材料表を参照してください。 4.スピンドルアセンブリ因子を導入注：ここで説明するアッセイでは、緑色蛍光タンパク質（GFP）は、Sの切断バージョンをタグ付きセレビシエダイニンは、人工的に33 -tagアミノ末端グルタチオンS-トランスフェラーゼ（GST）を用いて二量体化されたものを使用しました。このタンパク質は、タンパク質のIgG結合ドメインの2つのコピーを含有する親和性タグを介して精製しました。ここで使用される変異体は、カルボキシ末端およびN末端SNAPタグは、精製タンパク質をビオチン化するために使用されにテトラメチルローダミン（TMR）標識で標識されています。 。構文の詳細については、Roth氏ら 31を参照してください。精製詳細については、録音を参照してくださいK-ピーターソンら。33。 GFP-ビオチンダイニン-TMRは、ダイニンするビオチニル-PE脂質（ 図3E）にリンクビオチン-ストレプトアビジン複合体の形成を介して液滴皮質を標的とすることができます。 ドロップレットのCortexにターゲティングダイニン 「アッセイミックス」にGFP-ビオチンダイニン-TMRを含め30nmの最終液滴濃度である （ 表2を参照）。 200nmの最終液滴濃度で（ 表2参照）」アッセイミックス」にストレプトアビジンが含まれます。 注：ダイニンは微小管上の段階的運動のためのATP加水分解に依存しています。したがって、ATP及び「アッセイミックス'に（PEPおよびPK / LDHを含む）ATP再生系が挙げられる（ 表2参照）。 注：組換え完全長S.ポンベ GFP-Cut7（キネシン-5）が親切にディーツラボ（モレキュラー・バイオエンジニアリング、工科大学ドレスデン、ドレスデン、ドイツセンター）から提供された、参照してください。組換えフルリットルengthヒスチジンタグS.ポンベ GFP-ASE1は親切ヤンソンスラボ（ワーゲニンゲン大学、ワーゲニンゲン、オランダ）から提供され、80 nmの濃度で「アッセイミックス」に追加されました。 5.イメージング注：実験の間、微小管の成長温度を変えることによって制御することができます。撮影条件を選択する際に、トレードオフは、高品質画像と長い時間にわたってスピンドルアセンブリを監視する能力との間で行われなければなりません。異なる条件下での紡錘体形成の動態を比較するために、異なる内容の液滴は、同じ流路内で混合して撮像することができます。 基本的なイメージング設定密閉チャンバを使用して、温度制御された環境での画像。 26℃で〜30分後に個々の微小管を可視化します。イメージングしながら、30°C〜まで温度を上昇させることによって微小管成長を促進します。 注：■以下ettingsは、私たちの顕微鏡のセットアップに固有であり、異なるシステムや異なるオペレーティングソフトウェアに応じて変化することができます。ここに記載のアッセイのすべては、スピニングディスク共焦点ヘッドを備えた電動反転システム上に結像し、そのようなアンドールiQの3.1としてイメージングソフトウェアを使用して操作されます。 100X油浸対物レンズとEMCCDカメラですべての画像を取得します。 設定励起レーザ488、561及びおよそ〜10％の強度に641 nmの。 「買収」パネルに移動し「AOTF」タブをクリックして、10％にレーザー強度をスライドさせます。設定を保存するには、「記録」をクリックします。 zの -projectionsについては、1μmの間隔（〜20枚/液滴）を使用したスタックを取ります。 '、パネルをクリックして「メイン」カメラに行く編集Z'と設定Z 'ステップ'を1.0に。をクリックして「設定を保存するには、「次。 「買収」パネルで「カメラ」タブをクリックすることにより、最大線のEMゲインを設定し、300セットの暴露にEMゲインバーをスライドさせ同じタブで200ミリ秒に倍。設定を保存するには、「記録」をクリックします。 ライブイメージングライブイメージングのために、使用してソフトウェアのコントロールは、z -projectionsごとに2分を作ります。約100ミリ秒までの露光時間を減少させることによって1〜2時間の期間。 （5.1.3に記載されているように）（5.1.4で説明したように）と2μmのzの -intervalsを高めます。 「リピートトン」をクリックして、2分に設定し、メイン「カメラ」パネルに時系列を設定します。 120分の合計時間のための間隔。 ライブアッセイのために、液滴はできるだけ不動であることを確認するためにPDMSカップの代わりに、通常のフローセルを使用しています。 2条件の組み合わせイメージングマイクロフルイディクスを使用して液滴を生成し、氷上でPDMSコーティングされたスライドガラスの上に格納します。小滴の第二のセットが形成されるまでこれが微小管の核形成を防止します。液滴の第2のセットを生成する前に、PEEKチューブとを有するマイクロ流体チップを洗浄MRB80と完全に脂質/油相とマイクロ流体チップを補充します。 異なる色の液滴とを区別するために、蛍光デキストラン（または異なる波長の蛍光体でデキストランを使用する）場合とない場合の液滴を生成します。液滴の第二のバッチを製造した後、穏やかにピペッティングすることによって液滴を混合し、単一のフローセル/ PDMS-カップにロードします。 画像解析。 フィジー（オンライン利用可能なオープンソースソフトウェア）34を使用して画像を分析します。 「hyperstackするスタック ' – ' hyperstacks ' – ライブアッセイのために、「イメージ」を使用してhyperstacksにスタックを変換します。 zスライスおよびタイムフレームの正しい数を設定します。 Z-予測を行うために、「イメージ」を選択します – 'スタック' – 'zのプロジェクトを」。 「最大強度」投影を選択してください。 「プロパティ」ととの適切なピクセルを設定し、ピクセルheigth、ボクセルの深さとFR – 3D-再構成のために、最初の「画像」にアクセスしてくださいAME間隔。 「OK」をクリックします。 「イメージ」を選択してください – 'スタック' – '3Dプロジェクト」、「補間」ボックスをチェックし、「OK」をクリックします。