İn Vitro Transkripsiyon Tahliller ve İlaç Keşfi Onların Uygulama
Summary
In this manuscript, we describe a protocol to functionally examine transcription and the inhibitory activity of antibacterial agents targeting bacterial transcription.
Abstract
In vitro transkripsiyon analizleri geliştirilmiştir ve yaygın transkripsiyon rol oynayan moleküler mekanizmaları incelemek için yıllardır kullanılmaktadır. Bu işlem, çok-alt-birim DNA-bağımlı RNA polimeraz (rnap) ve gen ekspresyonu ne rnap aktivitesini modüle için harekete transkripsiyon faktörlerinin bir dizi gereklidir. radyoaktif işaretli transkript dizileme jel elektroforezi hangi parametreler bunu nasıl etkilediğini transkripsiyon ilerler ve ayrıntılı mekanistik bilgi vermek için kullanılır. Bu yazıda, esas uzama faktörü nusa transkripsiyonel duraklatma olarak rnap holoenzyme oluşumunun inhibisyonu yoluyla transkripsiyon inisiyasyon hedefleme bir antibakteriyel ajanı tanımlamak için bir yöntem düzenler nasıl çalışma protokol açıklar. Bu yöntemler de tam olarak bilinmemektedir transkripsiyon faktörlerinin etki mekanizması, aynı zamanda, yeni antibakteriyel agen keşfetmek için ilave yaklaşımlar geliştirilmesi için platform olarak kullanılabilirts antibiyotik araştırma ve geliştirme bir atıl ilaç hedefi olan transkripsiyonu hedefleyen.
Introduction
Transkripsiyon, RNA, belirli bir DNA şablonu sentez edildiği bir süreçtir. Ökaryotik hücrelerde üç farklı RNAPs vardır: rnap I rRNA öncüllerini transkripsiyonun rnap II mRNA ve bazı küçük nükleer RNA sentezi için sorumludur ve 5S rRNA ve tRNA sentezi rnap III ile gerçekleştirilir. bakteri, RNA, tüm sınıfları transkripsiyon sorumlu tek bir rnap vardır. başlatma, uzama ve sonlanma: transkripsiyon üç aşaması vardır. Transkripsiyon hücrede en çok düzenlenen süreçlerden biridir. Transkripsiyon döngüsünde Her aşamada gen ifadesinin 1 düzenlenmesi için bir kontrol noktasını temsil eder. Başlatılması için, rnap açık hızlandırıcı kompleks oluşturmak için yükselticiler 2 olarak adlandırılan belirli sitelere enzimi doğrudan gerekli olan, holoenzyme oluşturmak üzere bir sigma faktörü ile bağlanması gerekir. Daha sonra, transkripsiyon faktörleri büyük bir paketi düzenleme o sorumluduruzama ve sonlanma aşamalarında f rnap faaliyetleri. Burada incelenen transkripsiyon faktörü, nusa iyi muhafaza edilen ve temel bir proteindir. Bu rRNA sentezi 3-5 esnasında transkripsiyon duraklatma ve sonlandırma, ve anti-sonlandırma düzenlenmesinde rol oynar.
In vitro transkripsiyon deneyleri transkripsiyon 6 sırasında karmaşık düzenleyici adımlar incelemek için güçlü araçlar olarak geliştirilmiştir. Genel olarak, bir uyarıcı bölge içeren DNA doğrusal fragmanı transkripsiyonu için, şablon olarak gereklidir. DNA şablonu, genellikle PCR ile ya da bir plasmid doğrusallaştırılmış tarafından oluşturulur. Arıtılmış proteinler ve (algılama amaçlı bir radyoetiketlenmiş NTP dahil) NTP'ler eklenmiş ve ürün inkübasyon gerekli dönemini takip eden analiz edilmektedir. uygun şablonları ve reaksiyon koşullan kullanılarak, transkripsiyon tüm aşamaları TRANSCR ayrıntılı moleküler karakterizasyonu sağladı, bu yaklaşım kullanılarak incelenmiştirSon yarım yüzyıl 7 üzerinde iption. Rnap 3-boyutlu yapısı ile ilgili bilgi ile birlikte de antibiyotik ve antibiyotik potansiyel transkripsiyon inhibisyonu moleküler mekanizması prob, ve yeni, iyileştirilmiş ilaç 8-10 geliştirilmesinde bu bilgileri kullanmak mümkün olmuştur.
Bu çalışmada, transkripsiyon deneyleri transkripsiyon uzama / sonlandırma faktörü Nusa ve nasıl yeni bir transkripsiyon başlatma inhibitörü kurşun etki mekanizması tespit edilebilir tarafından düzenlenmesi mekanizmasını belirlemek için nasıl kullanılabileceği örnekler sunmak.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bütün organizmalarda, transkripsiyon bir sıkı regüle süreçtir. Transkripsiyon analizleri transkripsiyon faktörleri, küçük moleküller ve transkripsiyon inhibitörlerinin etkilerini test etmek için bir platform sağlamak için geliştirilmiştir in vitro. Bu yöntem, bir kağıt, genel bakteriyel transkripsiyon için bir tahlil tanımlanmıştır. Onlar bir zaman çizgisi boyunca tüm transkripsiyon ürünlerinin görselleştirme izin olarak transkript dizi jel elektroforezi ile kombine transkripsiyo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work acknowledges a Faculty Early Career Grant from the University of Newcastle (CM).
Materials
| Obtain the proteins required for transcription assay | |||
| E. coli RNAP | Epicentre | S90250 | |
| Preparation of DEPC-treated water | |||
| diethyl pyrocarbonate (DEPC) | Sigma-Aldrich | D5758 | |
| RNase-free water | |||
| Ambion Nuclease-Free Water | ThermoFisher | AM9937 | |
| DNA template preparation | |||
| Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System | Promega | A1330 | |
| ACCUZYME Mix | Bioline | BIO-25028 | |
| PCR primers | |||
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9281 | |
| NanoDrop 3300 fluorospectrometer | Thermo Scientific | ND-3300 | |
| NTP Preparation | |||
| ATP | Sigma-Aldrich | A6559 | |
| UTP | Sigma-Aldrich | U1006 | |
| GTP | Sigma-Aldrich | G3776 | |
| CTP | Sigma-Aldrich | C9274 | |
| High Purity rNTPs | GE Healthcare | 27-2025-01 | |
| α-32P UTP | PerkinElmer | BLU007C001MC | Radioactive compound |
| RNA ladder preparation | |||
| Novagen Perfect RNA Marker Template Mix 0.1–1 kb | Millipore | 69003 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H7006 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | DTT-RO | |
| T7 RNAP | Promega | P2075 | |
| Gel preparation | |||
| Sequi-Gen GT nucleic acid sequencing cell | Bio-Rad | 165-3804 | |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2 | |
| urea | Sigma-Aldrich | U6504 | |
| tris(hydroxymethyl)aminomethane | Sigma-Aldrich | 154563 | |
| boric acid | Sigma-Aldrich | B7901 | |
| ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | ED | |
| 40% Acrylamide/bis-acrylamide | Sigma-Aldrich | A9926 | |
| ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| N,N,Nʹ′,Nʹ′-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| N,N,N”,N”-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Transcription Assay | |||
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| rifampicin | Sigma-Aldrich | R3501 | |
| formamide | Sigma-Aldrich | F9037 | |
| bromophenol blue | Sigma-Aldrich | B0126 | |
| xylene cyanol | Sigma-Aldrich | X4126 | |
| heparin | Sigma-Aldrich | 84020 | |
| RNasin Ribonuclease Inhibitor | Promega | N2511 | |
| Transcription buffer | |||
| Tris base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | DTT-RO | |
| glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Filter paper | |||
| Whatman 3MM Chr Chromatography Paper | Fisher Scientific | 05-714-5 | |
| Radioactive decontaminant | |||
| Decon 90 | decon | decon90 | |
| Gel Treatment | |||
| Typhoon Trio+ imager | GE Healthcare Life Sciences | 63-0055-89 |
References
- Mooney, R. A., Artsimovitch, I., Landick, R. Information processing by RNA polymerase: recognition of regulatory signals during RNA chain elongation. J. Bacteriol. 180 (13), 3265-3275 (1998).
- Burgess, R. R., Anthony, L. How sigma docks to RNA polymerase and what sigma does. Curr. Opin. Microbiol. 4 (2), 126-131 (2001).
- Gusarov, I., Nudler, E. Control of intrinsic transcription termination by N and NusA: the basic mechanisms. Cell. 107 (4), 437-449 (2001).
- Ha, K. S., Toulokhonov, I., Vassylyev, D. G., Landick, R. The NusA N-terminal domain is necessary and sufficient for enhancement of transcriptional pausing via interaction with the RNA exit channel of RNA polymerase. J. Mol. Biol. 401 (5), 708-725 (2010).
- Yang, X., Lewis, P. J. The interaction between RNA polymerase and the elongation factor NusA. RNA Biol. 7 (3), 272-275 (2010).
- Artsimovitch, I., Henkin, T. M. In vitro approaches to analysis of transcription termination. Methods. 47 (1), 37-43 (2009).
- Decker, K. B., Hinton, D. M. Transcription regulation at the core: Similarities among bacterial, archaeal, and eukaryotic RNA polymerases. Annu. Rev. Microbiol. 67, 113-139 (2013).
- Artsimovitch, I., Vassylyev, D. G. Is it easy to stop RNA polymerase?. Cell Cycle. 5 (4), 399-404 (2006).
- Murakami, K. S. Structural biology of bacterial RNA polymerase. Biomolecules. 5 (2), 848-864 (2015).
- Ma, C., Yang, X., Lewis, P. J. Bacterial transcription as a target for antibacterial drug development. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 80 (1), 139-160 (2016).
- Yang, X., Ma, C., Lewis, P. A vector system that allows simple generation of mutant Escherichia coli RNA polymerase. Plasmid. 75, 37-41 (2014).
- Burgess, R. R. A new method for the large scale purification of Escherichia coli deoxyribonucleic acid-dependent ribonucleic acid polymerase. J. Biol. Chem. 244, 6160-6167 (1969).
- Artsimovitch, I., Svetlov, V., Murakami, K. S., Landick, R. Co-overexpression of Escherichia coli RNA polymerase subunits allows isolation and analysis of mutant enzymes lacking lineage-specific sequence insertions. J. Biol. Chem. 278 (14), 12344-12355 (2003).
- Ma, C., Yang, X., Lewis, P. J. Bacterial transcription inhibitor of RNA polymerase holoenzyme formation by structure-based drug design: From in silico screening to validation. ACS Infect. Dis. 2, 39-46 (2016).
- Ma, C., Mobli, M., Yang, X., Keller, A. N., King, G. F., Lewis, P. J. RNA polymerase-induced remodelling of NusA produces a pause enhancement complex. Nucleic Acids Res. 43 (5), 2829-2840 (2015).
- Lewis, P. J., Marston, A. L. GFP vectors for controlled expression and dual labelling of protein fusions in Bacillus subtilis. Gene. 227 (1), 101-110 (1999).
- Artsimovitch, I., Landick, R. Pausing by bacterial RNA polymerase is mediated by mechanistically distinct classes of signals. Proc. Natl. Acad. Sci. 97 (13), 7090-7095 (2000).
- Vassylyev, D. G., et al. Crystal structure of a bacterial RNA polymerase holoenzyme at 2.6 Å resolution. Nature. 417, 712-719 (2002).
- Artsimovitch, I., et al. Structural basis for transcription regulation by alarmone ppGpp. Cell. 117 (3), 299-310 (2004).
- Bordier, C. Inhibition of rifampicin-resistant RNA synthesis by rifampicin-RNA polymerase complexes. FEBS lett. 45 (1-2), 259-262 (1974).
- Tang, G. Q., Anand, V. S., Patel, S. S. Fluorescence-based assay to measure the real-time kinetics of nucleotide incorporation during transcription elongation. J. Mol. Biol. 405 (3), 666-678 (2011).
