In Vitro Транскрипция Анализы и их применение в Drug Discovery
Summary
In this manuscript, we describe a protocol to functionally examine transcription and the inhibitory activity of antibacterial agents targeting bacterial transcription.
Abstract
В пробирке транскрипции анализы были разработаны и широко использовались в течение многих лет , чтобы изучить молекулярные механизмы , участвующие в транскрипции. Этот процесс требует множества субъединиц ДНК-зависимой РНК-полимеразы (РНКП) и ряд факторов транскрипции, которые действуют, чтобы модулировать активность РНКП во время экспрессии генов. Секвенирование гель-электрофорез радиоактивно меченных транскриптов используется, чтобы обеспечить подробную механистическую информацию о том, как Транскрипция происходит, и какие параметры могут повлиять на нее. В этой статье мы опишем протокол для изучения того, как существенный фактор элонгации Нуса регулирует транскрипционный приостановку, а также способ идентификации антибактериальный агент таргетирования инициации транскрипции путем ингибирования холофермента формирования РНКП. Эти методы могут быть использован в качестве платформы для разработки дополнительных подходов для изучения механизма действия факторов транскрипции, которые до сих пор остаются неясными, а также новые антибактериальные AgenТ.С. ориентации транскрипции, которая является объектом недоиспользованными наркотиков в исследования и разработки антибиотиков.
Introduction
Транскрипция является процессом, в котором РНК синтезируется из определенной ДНК-матрицы. В эукариотических клетках имеются три различных РНКП: РНК-полимераза I расшифровывает предшественников рРНК, РНК-полимераза II отвечает за синтез мРНК и определенных малых ядерных РНК, и синтез 5S рРНК и тРНК осуществляется РНКП III. У бактерий существует только одна РНК-полимераза отвечает за транскрипцию всех классов РНК. Есть три стадии транскрипции: инициация, удлинение и прекращение. Транскрипция является одним из наиболее регулируемых процессов в клетке. Каждая стадия в цикле транскрипции представляет собой контрольную точку для регуляции экспрессии генов 1. Для инициирования, РНК – полимераза должен ассоциировать с коэффициентом сигмы с образованием Голоэнзим, которое требуется , чтобы направить фермента к определенным узлам , называемые промоторами 2 с образованием открытого промотора комплекса. Впоследствии, большой набор факторов транскрипции отвечают за регулирование Oдеятельность F РНКП во время удлинения и терминации фаз. Фактор транскрипции рассматриваемых здесь является высоко консервативным и существенным содержанием белка, Нуса. Он участвует в регуляции транскрипции Приостановка и прекращение, а также анти-терминацию в процессе синтеза рРНК 3-5.
В пробирке транскрипции анализы были разработаны в качестве мощных инструментов для изучения сложных регуляторных мер во время транскрипции 6. В общем случае, линейный фрагмент ДНК, в том числе области промотора необходим в качестве матрицы для транскрипции. ДНК-матрицы, как правило, генерируются с помощью ПЦР или путем линеаризации плазмиды. Затем добавляют Очищенные белки и НТП (в том числе один меченый NTP для обнаружения целей) и продукт анализировали после необходимого периода инкубации. С использованием соответствующих шаблонов и условий реакции, все этапы транскрипции были исследованы с помощью этого подхода, который позволил подробную молекулярную характеристику Transcription за последние полвека 7. В сочетании с информацией о 3-мерной структуре РНКП это также оказалось возможным исследовать молекулярный механизм ингибирования транскрипции антибиотиков и антибиотиков приводит, и использовать эту информацию при разработке новых, усовершенствованных лекарств 8-10.
В данной работе мы приводим примеры того, как транскрипционные анализы могут быть использованы для определения механизма регуляции транскрипции путем удлинения / фактора прекращения Нуса, а также как механизм действия нового ингибитора инициации транскрипции свинца может быть определена.
Protocol
Representative Results
Discussion
Во всех организмах, транскрипция является жестко регулируется процесс. В пробирке транскрипции анализы были разработаны , чтобы обеспечить платформу для тестирования эффектов транскрипционных факторов, малых молекул и ингибиторов транскрипции. В этом методе бумаги, анализ мето?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work acknowledges a Faculty Early Career Grant from the University of Newcastle (CM).
Materials
| Obtain the proteins required for transcription assay | |||
| E. coli RNAP | Epicentre | S90250 | |
| Preparation of DEPC-treated water | |||
| diethyl pyrocarbonate (DEPC) | Sigma-Aldrich | D5758 | |
| RNase-free water | |||
| Ambion Nuclease-Free Water | ThermoFisher | AM9937 | |
| DNA template preparation | |||
| Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System | Promega | A1330 | |
| ACCUZYME Mix | Bioline | BIO-25028 | |
| PCR primers | |||
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9281 | |
| NanoDrop 3300 fluorospectrometer | Thermo Scientific | ND-3300 | |
| NTP Preparation | |||
| ATP | Sigma-Aldrich | A6559 | |
| UTP | Sigma-Aldrich | U1006 | |
| GTP | Sigma-Aldrich | G3776 | |
| CTP | Sigma-Aldrich | C9274 | |
| High Purity rNTPs | GE Healthcare | 27-2025-01 | |
| α-32P UTP | PerkinElmer | BLU007C001MC | Radioactive compound |
| RNA ladder preparation | |||
| Novagen Perfect RNA Marker Template Mix 0.1–1 kb | Millipore | 69003 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H7006 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | DTT-RO | |
| T7 RNAP | Promega | P2075 | |
| Gel preparation | |||
| Sequi-Gen GT nucleic acid sequencing cell | Bio-Rad | 165-3804 | |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2 | |
| urea | Sigma-Aldrich | U6504 | |
| tris(hydroxymethyl)aminomethane | Sigma-Aldrich | 154563 | |
| boric acid | Sigma-Aldrich | B7901 | |
| ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | ED | |
| 40% Acrylamide/bis-acrylamide | Sigma-Aldrich | A9926 | |
| ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| N,N,Nʹ′,Nʹ′-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| N,N,N”,N”-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Transcription Assay | |||
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| rifampicin | Sigma-Aldrich | R3501 | |
| formamide | Sigma-Aldrich | F9037 | |
| bromophenol blue | Sigma-Aldrich | B0126 | |
| xylene cyanol | Sigma-Aldrich | X4126 | |
| heparin | Sigma-Aldrich | 84020 | |
| RNasin Ribonuclease Inhibitor | Promega | N2511 | |
| Transcription buffer | |||
| Tris base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | DTT-RO | |
| glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Filter paper | |||
| Whatman 3MM Chr Chromatography Paper | Fisher Scientific | 05-714-5 | |
| Radioactive decontaminant | |||
| Decon 90 | decon | decon90 | |
| Gel Treatment | |||
| Typhoon Trio+ imager | GE Healthcare Life Sciences | 63-0055-89 |
References
- Mooney, R. A., Artsimovitch, I., Landick, R. Information processing by RNA polymerase: recognition of regulatory signals during RNA chain elongation. J. Bacteriol. 180 (13), 3265-3275 (1998).
- Burgess, R. R., Anthony, L. How sigma docks to RNA polymerase and what sigma does. Curr. Opin. Microbiol. 4 (2), 126-131 (2001).
- Gusarov, I., Nudler, E. Control of intrinsic transcription termination by N and NusA: the basic mechanisms. Cell. 107 (4), 437-449 (2001).
- Ha, K. S., Toulokhonov, I., Vassylyev, D. G., Landick, R. The NusA N-terminal domain is necessary and sufficient for enhancement of transcriptional pausing via interaction with the RNA exit channel of RNA polymerase. J. Mol. Biol. 401 (5), 708-725 (2010).
- Yang, X., Lewis, P. J. The interaction between RNA polymerase and the elongation factor NusA. RNA Biol. 7 (3), 272-275 (2010).
- Artsimovitch, I., Henkin, T. M. In vitro approaches to analysis of transcription termination. Methods. 47 (1), 37-43 (2009).
- Decker, K. B., Hinton, D. M. Transcription regulation at the core: Similarities among bacterial, archaeal, and eukaryotic RNA polymerases. Annu. Rev. Microbiol. 67, 113-139 (2013).
- Artsimovitch, I., Vassylyev, D. G. Is it easy to stop RNA polymerase?. Cell Cycle. 5 (4), 399-404 (2006).
- Murakami, K. S. Structural biology of bacterial RNA polymerase. Biomolecules. 5 (2), 848-864 (2015).
- Ma, C., Yang, X., Lewis, P. J. Bacterial transcription as a target for antibacterial drug development. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 80 (1), 139-160 (2016).
- Yang, X., Ma, C., Lewis, P. A vector system that allows simple generation of mutant Escherichia coli RNA polymerase. Plasmid. 75, 37-41 (2014).
- Burgess, R. R. A new method for the large scale purification of Escherichia coli deoxyribonucleic acid-dependent ribonucleic acid polymerase. J. Biol. Chem. 244, 6160-6167 (1969).
- Artsimovitch, I., Svetlov, V., Murakami, K. S., Landick, R. Co-overexpression of Escherichia coli RNA polymerase subunits allows isolation and analysis of mutant enzymes lacking lineage-specific sequence insertions. J. Biol. Chem. 278 (14), 12344-12355 (2003).
- Ma, C., Yang, X., Lewis, P. J. Bacterial transcription inhibitor of RNA polymerase holoenzyme formation by structure-based drug design: From in silico screening to validation. ACS Infect. Dis. 2, 39-46 (2016).
- Ma, C., Mobli, M., Yang, X., Keller, A. N., King, G. F., Lewis, P. J. RNA polymerase-induced remodelling of NusA produces a pause enhancement complex. Nucleic Acids Res. 43 (5), 2829-2840 (2015).
- Lewis, P. J., Marston, A. L. GFP vectors for controlled expression and dual labelling of protein fusions in Bacillus subtilis. Gene. 227 (1), 101-110 (1999).
- Artsimovitch, I., Landick, R. Pausing by bacterial RNA polymerase is mediated by mechanistically distinct classes of signals. Proc. Natl. Acad. Sci. 97 (13), 7090-7095 (2000).
- Vassylyev, D. G., et al. Crystal structure of a bacterial RNA polymerase holoenzyme at 2.6 Å resolution. Nature. 417, 712-719 (2002).
- Artsimovitch, I., et al. Structural basis for transcription regulation by alarmone ppGpp. Cell. 117 (3), 299-310 (2004).
- Bordier, C. Inhibition of rifampicin-resistant RNA synthesis by rifampicin-RNA polymerase complexes. FEBS lett. 45 (1-2), 259-262 (1974).
- Tang, G. Q., Anand, V. S., Patel, S. S. Fluorescence-based assay to measure the real-time kinetics of nucleotide incorporation during transcription elongation. J. Mol. Biol. 405 (3), 666-678 (2011).
