in vitro転写アッセイおよび創薬への応用
Summary
In this manuscript, we describe a protocol to functionally examine transcription and the inhibitory activity of antibacterial agents targeting bacterial transcription.
Abstract
インビトロ転写アッセイが開発され、広く転写に関与する分子メカニズムを研究するために長年使用します。このプロセスは、マルチサブユニットのDNA依存性RNAポリメラーゼ（RNAP）遺伝子発現時RNAPの活性を調節するように作用する転写因子のシリーズを必要とします。放射性標識された転写物の配列決定ゲル電気泳動は、それに影響を与えることができる方法の転写が進行するとどのようなパラメータの詳細な機構的情報を提供するために使用されます。本稿では、本質的な伸長因子ヌサは、転写一時停止、ならびにRNAPホロ酵素形成の阻害を介して転写開始をターゲットに抗菌剤を同定する方法を調整する方法を研究するためのプロトコルについて説明します。これらの方法は、まだ不明である転写因子の作用機序を調査するための追加の方法、ならびに新規な抗菌アーガンを開発するためのプラットフォームとして使用することができますtsが、抗生物質の研究開発における遊休薬物標的である転写をターゲットに。
Introduction
転写は、RNAは、特定のDNA鋳型から合成する処理です。真核細胞では三つの異なるRNAPsありますRNAP私はrRNAの前駆体を転写は、RNAP IIは、mRNAおよび特定小核RNAの合成のために責任がある、と5SのrRNAとtRNAの合成は、RNAP IIIによって行われます。細菌では、RNAのすべてのクラスの転写を担当する唯一のRNAPがあります。開始、伸長および終結：転写の3つの段階があります。転写は、細胞の中で最も高度に調節プロセスの一つです。 転写サイクルの各ステージは、遺伝子発現1の調節のためのチェックポイントを表します。開始のため、RNAPはオープンプロモーター複合体を形成するために、プロモーター2と呼ばれる特定の部位に酵素を誘導するように要求される、ホロ酵素を形成するためにシグマ因子に関連付けるました。続いて、転写因子の大きなスイートは、規制Oを担当しています伸びと終了フェーズ時にf RNAP活動。ここで調べた転写因子は、ヌサ高度に保存された必須タンパク質です。これは、rRNAの合成3-5の間に転写停止および終了、ならびに抗終結の調節に関与しています。
インビトロ転写アッセイでは転写6時の複雑な規制の手順を研究するための強力なツールとして開発されてきました。一般的に、プロモーター領域を含むDNAの線状断片は、転写のテンプレートとして必要とされます。 DNAテンプレートは、通常、PCRによって、またはプラスミドを線形化することによって生成されます。 （検出目的のための1つの放射性標識NTPを含む）、精製されたタンパク質とのNTPを添加すると、生成物は、インキュベーションの必要な期間の後に分析しました。適切なテンプレートおよび反応条件を使用して、転写のすべての段階はtranscrの詳細な分子特性解析を可能にしたこのアプローチを用いて検討されています最後の半世紀7オーバーiption。 RNAPの3次元構造に関する情報と組み合わせて、また、抗生物質および抗生物質のリードによる転写抑制の分子機構を精査し、新しい、改善された薬物8-10の開発にこの情報を使用することが可能でした。
本研究で、我々は、転写アッセイ転写伸長/終結因子ヌサによる調節のメカニズムを決定するために使用できる方法の例を提供する方法、および新規な転写開始阻害、リードの作用機序を決定することができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
全ての生物において、転写は厳密に制御プロセスである。 インビトロ転写アッセイ転写因子、小分子および転写阻害剤の効果を試験するためのプラットフォームを提供するために開発されてきました。この方法の論文では、一般的な細菌の転写のためのアッセイを説明しました。彼らはタイムラインに沿ってすべての転写産物の可視化を可能として転写産物の配列決定ゲル電気泳動と…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work acknowledges a Faculty Early Career Grant from the University of Newcastle (CM).
Materials
| Obtain the proteins required for transcription assay | |||
| E. coli RNAP | Epicentre | S90250 | |
| Preparation of DEPC-treated water | |||
| diethyl pyrocarbonate (DEPC) | Sigma-Aldrich | D5758 | |
| RNase-free water | |||
| Ambion Nuclease-Free Water | ThermoFisher | AM9937 | |
| DNA template preparation | |||
| Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System | Promega | A1330 | |
| ACCUZYME Mix | Bioline | BIO-25028 | |
| PCR primers | |||
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9281 | |
| NanoDrop 3300 fluorospectrometer | Thermo Scientific | ND-3300 | |
| NTP Preparation | |||
| ATP | Sigma-Aldrich | A6559 | |
| UTP | Sigma-Aldrich | U1006 | |
| GTP | Sigma-Aldrich | G3776 | |
| CTP | Sigma-Aldrich | C9274 | |
| High Purity rNTPs | GE Healthcare | 27-2025-01 | |
| α-32P UTP | PerkinElmer | BLU007C001MC | Radioactive compound |
| RNA ladder preparation | |||
| Novagen Perfect RNA Marker Template Mix 0.1–1 kb | Millipore | 69003 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H7006 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | DTT-RO | |
| T7 RNAP | Promega | P2075 | |
| Gel preparation | |||
| Sequi-Gen GT nucleic acid sequencing cell | Bio-Rad | 165-3804 | |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2 | |
| urea | Sigma-Aldrich | U6504 | |
| tris(hydroxymethyl)aminomethane | Sigma-Aldrich | 154563 | |
| boric acid | Sigma-Aldrich | B7901 | |
| ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | ED | |
| 40% Acrylamide/bis-acrylamide | Sigma-Aldrich | A9926 | |
| ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| N,N,Nʹ′,Nʹ′-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| N,N,N”,N”-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Transcription Assay | |||
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| rifampicin | Sigma-Aldrich | R3501 | |
| formamide | Sigma-Aldrich | F9037 | |
| bromophenol blue | Sigma-Aldrich | B0126 | |
| xylene cyanol | Sigma-Aldrich | X4126 | |
| heparin | Sigma-Aldrich | 84020 | |
| RNasin Ribonuclease Inhibitor | Promega | N2511 | |
| Transcription buffer | |||
| Tris base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | DTT-RO | |
| glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Filter paper | |||
| Whatman 3MM Chr Chromatography Paper | Fisher Scientific | 05-714-5 | |
| Radioactive decontaminant | |||
| Decon 90 | decon | decon90 | |
| Gel Treatment | |||
| Typhoon Trio+ imager | GE Healthcare Life Sciences | 63-0055-89 |
References
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