النسخ في المختبر فحوصات وتطبيقها في اكتشاف الأدوية
Summary
In this manuscript, we describe a protocol to functionally examine transcription and the inhibitory activity of antibacterial agents targeting bacterial transcription.
Abstract
في المختبر وتم وضع المقايسات النسخ وتستخدم على نطاق واسع لسنوات عديدة لدراسة الآليات الجزيئية تشارك في النسخ. وتتطلب هذه العملية متعددة فرعية تعتمد على الحمض النووي RNA البلمرة (RNAP) ومجموعة من عوامل النسخ التي تعمل على تعديل نشاط RNAP خلال التعبير الجيني. ويستخدم هلام التسلسل الكهربائي من النصوص رديولبلد لتوفير المعلومات الآلية مفصلة حول كيفية عائدات النسخ، وما هي مواصفات يمكن أن تؤثر عليه. في هذه الورقة وصفنا بروتوكول لدراسة كيفية عامل استطالة ضروري نوسا ينظم التوقف النسخي، وكذلك وسيلة للتعرف على مادة مضادة للبكتريا التي تستهدف بدء النسخ من خلال تثبيط RNAP تشكيل عميم الإنزيم. هذه الأساليب يمكن أن تستخدم كمنصة لتطوير مناهج إضافية لاستكشاف آلية العمل من عوامل النسخ التي ما زالت تزال غير واضحة، وكذلك آجا المضادة للبكتيريا جديدةنهاية الخبر تستهدف النسخ وهو الهدف المخدرات غير مستخدمة بالقدر الكافي في البحث والتطوير للمضادات الحيوية.
Introduction
النسخ هو العملية التي يتم توليفها من الحمض النووي الريبي DNA قالب معين. في الخلايا حقيقية النواة هناك ثلاثة RNAPs متميزة: RNAP أنا المحاضر السلائف الريباسي، RNAP الثاني هو المسؤول عن تخليق مرنا وبعض الرنا نووية صغيرة، ويتم تنفيذ تركيب 5S الريباسي والحمض الريبي النووي النقال من قبل RNAP الثالث. في البكتيريا، لا يوجد سوى RNAP واحدة مسؤولة عن نسخ من جميع الطبقات من الحمض النووي الريبي. هناك ثلاث مراحل النسخ: بدء، واستطالة وإنهاء الخدمة. النسخ هي واحدة من العمليات الأكثر ينظم غاية في الخلية. كل مرحلة من مراحل دورة النسخ تمثل نقطة تفتيش لتنظيم التعبير الجيني 1. لبدء، RNAP أن اقترانه عامل سيغما لتشكيل عميم الإنزيم، وهو مطلوب لتوجيه الإنزيم إلى مواقع معينة تسمى المروجين 2 لتشكيل مجمع المروج مفتوحة. وفي وقت لاحق، مجموعة كبيرة من عوامل النسخ هي المسؤولة عن تنظيم سالأنشطة و RNAP خلال استطالة وإنهاء مراحل. عامل النسخ فحص هنا هو البروتين الحفظ جدا وأساسي، نوسا. وتشارك في تنظيم التوقف النسخ وإنهاء الخدمة، وكذلك مكافحة إنهاء خلال التوليف الريباسي 3-5.
في المختبر تم تطويرها المقايسات النسخ كأدوات قوية لدراسة الخطوات التنظيمية المعقدة خلال النسخ 6. بشكل عام، لا بد من جزء طولي من الحمض النووي بما في ذلك منطقة المروج كقالب لالنسخ. عادة يتم إنشاء قالب الحمض النووي عن طريق PCR أو linearizing البلازميد. ثم تضاف تنقية البروتينات والبرامج الوطنية (بما في ذلك رديولبلد واحد NTP لأغراض الكشف) والمنتج تحليل بعد فترة المطلوبة من الحضانة. باستخدام القوالب المناسبة وظروف التفاعل، وقد تم فحص جميع مراحل النسخ باستخدام هذا النهج الذي مكن التوصيف الجزيئي مفصل من transcription خلال نصف القرن الماضي 7. جنبا إلى جنب مع معلومات عن هيكل 3-الأبعاد من RNAP كان من الممكن أيضا للتحقيق في الآلية الجزيئية لتثبيط النسخ بواسطة المضادات الحيوية ويؤدي للمضادات الحيوية، واستخدام هذه المعلومات في تطوير جديدة، والمخدرات تحسين 8-10.
في هذا العمل ونحن تقديم أمثلة عن كيف يمكن استخدام المقايسات النسخ لتحديد آلية التنظيم من قبل النسخ استطالة / عامل إنهاء نوسا، وكيف أن آلية عمل رواية بدء النسخ المانع الرصاص يمكن تحديدها.
Protocol
Representative Results
Discussion
في جميع الكائنات الحية، والنسخ هو عملية تنظيم محكم. في المختبر وضعت المقايسات النسخ لتوفير منصة لاختبار آثار عوامل النسخ، والجزيئات الصغيرة ومثبطات النسخ. في هذه الورقة الأسلوب، وقد وصفت مقايسة لنسخ البكتيرية العام. المقايسات النسخ جنبا إلى جنب مع تسلسل هلام ا?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work acknowledges a Faculty Early Career Grant from the University of Newcastle (CM).
Materials
| Obtain the proteins required for transcription assay | |||
| E. coli RNAP | Epicentre | S90250 | |
| Preparation of DEPC-treated water | |||
| diethyl pyrocarbonate (DEPC) | Sigma-Aldrich | D5758 | |
| RNase-free water | |||
| Ambion Nuclease-Free Water | ThermoFisher | AM9937 | |
| DNA template preparation | |||
| Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System | Promega | A1330 | |
| ACCUZYME Mix | Bioline | BIO-25028 | |
| PCR primers | |||
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9281 | |
| NanoDrop 3300 fluorospectrometer | Thermo Scientific | ND-3300 | |
| NTP Preparation | |||
| ATP | Sigma-Aldrich | A6559 | |
| UTP | Sigma-Aldrich | U1006 | |
| GTP | Sigma-Aldrich | G3776 | |
| CTP | Sigma-Aldrich | C9274 | |
| High Purity rNTPs | GE Healthcare | 27-2025-01 | |
| α-32P UTP | PerkinElmer | BLU007C001MC | Radioactive compound |
| RNA ladder preparation | |||
| Novagen Perfect RNA Marker Template Mix 0.1–1 kb | Millipore | 69003 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H7006 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | DTT-RO | |
| T7 RNAP | Promega | P2075 | |
| Gel preparation | |||
| Sequi-Gen GT nucleic acid sequencing cell | Bio-Rad | 165-3804 | |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2 | |
| urea | Sigma-Aldrich | U6504 | |
| tris(hydroxymethyl)aminomethane | Sigma-Aldrich | 154563 | |
| boric acid | Sigma-Aldrich | B7901 | |
| ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | ED | |
| 40% Acrylamide/bis-acrylamide | Sigma-Aldrich | A9926 | |
| ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| N,N,Nʹ′,Nʹ′-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| N,N,N”,N”-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Transcription Assay | |||
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| rifampicin | Sigma-Aldrich | R3501 | |
| formamide | Sigma-Aldrich | F9037 | |
| bromophenol blue | Sigma-Aldrich | B0126 | |
| xylene cyanol | Sigma-Aldrich | X4126 | |
| heparin | Sigma-Aldrich | 84020 | |
| RNasin Ribonuclease Inhibitor | Promega | N2511 | |
| Transcription buffer | |||
| Tris base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | DTT-RO | |
| glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Filter paper | |||
| Whatman 3MM Chr Chromatography Paper | Fisher Scientific | 05-714-5 | |
| Radioactive decontaminant | |||
| Decon 90 | decon | decon90 | |
| Gel Treatment | |||
| Typhoon Trio+ imager | GE Healthcare Life Sciences | 63-0055-89 |
References
- Mooney, R. A., Artsimovitch, I., Landick, R. Information processing by RNA polymerase: recognition of regulatory signals during RNA chain elongation. J. Bacteriol. 180 (13), 3265-3275 (1998).
- Burgess, R. R., Anthony, L. How sigma docks to RNA polymerase and what sigma does. Curr. Opin. Microbiol. 4 (2), 126-131 (2001).
- Gusarov, I., Nudler, E. Control of intrinsic transcription termination by N and NusA: the basic mechanisms. Cell. 107 (4), 437-449 (2001).
- Ha, K. S., Toulokhonov, I., Vassylyev, D. G., Landick, R. The NusA N-terminal domain is necessary and sufficient for enhancement of transcriptional pausing via interaction with the RNA exit channel of RNA polymerase. J. Mol. Biol. 401 (5), 708-725 (2010).
- Yang, X., Lewis, P. J. The interaction between RNA polymerase and the elongation factor NusA. RNA Biol. 7 (3), 272-275 (2010).
- Artsimovitch, I., Henkin, T. M. In vitro approaches to analysis of transcription termination. Methods. 47 (1), 37-43 (2009).
- Decker, K. B., Hinton, D. M. Transcription regulation at the core: Similarities among bacterial, archaeal, and eukaryotic RNA polymerases. Annu. Rev. Microbiol. 67, 113-139 (2013).
- Artsimovitch, I., Vassylyev, D. G. Is it easy to stop RNA polymerase?. Cell Cycle. 5 (4), 399-404 (2006).
- Murakami, K. S. Structural biology of bacterial RNA polymerase. Biomolecules. 5 (2), 848-864 (2015).
- Ma, C., Yang, X., Lewis, P. J. Bacterial transcription as a target for antibacterial drug development. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 80 (1), 139-160 (2016).
- Yang, X., Ma, C., Lewis, P. A vector system that allows simple generation of mutant Escherichia coli RNA polymerase. Plasmid. 75, 37-41 (2014).
- Burgess, R. R. A new method for the large scale purification of Escherichia coli deoxyribonucleic acid-dependent ribonucleic acid polymerase. J. Biol. Chem. 244, 6160-6167 (1969).
- Artsimovitch, I., Svetlov, V., Murakami, K. S., Landick, R. Co-overexpression of Escherichia coli RNA polymerase subunits allows isolation and analysis of mutant enzymes lacking lineage-specific sequence insertions. J. Biol. Chem. 278 (14), 12344-12355 (2003).
- Ma, C., Yang, X., Lewis, P. J. Bacterial transcription inhibitor of RNA polymerase holoenzyme formation by structure-based drug design: From in silico screening to validation. ACS Infect. Dis. 2, 39-46 (2016).
- Ma, C., Mobli, M., Yang, X., Keller, A. N., King, G. F., Lewis, P. J. RNA polymerase-induced remodelling of NusA produces a pause enhancement complex. Nucleic Acids Res. 43 (5), 2829-2840 (2015).
- Lewis, P. J., Marston, A. L. GFP vectors for controlled expression and dual labelling of protein fusions in Bacillus subtilis. Gene. 227 (1), 101-110 (1999).
- Artsimovitch, I., Landick, R. Pausing by bacterial RNA polymerase is mediated by mechanistically distinct classes of signals. Proc. Natl. Acad. Sci. 97 (13), 7090-7095 (2000).
- Vassylyev, D. G., et al. Crystal structure of a bacterial RNA polymerase holoenzyme at 2.6 Å resolution. Nature. 417, 712-719 (2002).
- Artsimovitch, I., et al. Structural basis for transcription regulation by alarmone ppGpp. Cell. 117 (3), 299-310 (2004).
- Bordier, C. Inhibition of rifampicin-resistant RNA synthesis by rifampicin-RNA polymerase complexes. FEBS lett. 45 (1-2), 259-262 (1974).
- Tang, G. Q., Anand, V. S., Patel, S. S. Fluorescence-based assay to measure the real-time kinetics of nucleotide incorporation during transcription elongation. J. Mol. Biol. 405 (3), 666-678 (2011).
